质粒构建

我构质粒，上下游的P的片段大小都是对的，都是750bp，然后我载体用单酶切，之后连接，结果连接出来验证上下游大小都在2000bp，然后我就送出去测序，发现多出来的bp是上下游之间的目的片段，就是我要敲掉的目的片段，可是没有任何引物可以扩增出它，然后我觉得可能是引物的问题，所以我换了引物，上下游同源臂大小也换成800，结果这次连接出来的质粒验证还是在2000以上那里。

第一次扩出来2000的时候，我用上下游作为模板，然后去高保真，扩成一条同源臂是1500左右，这样去连接，连接出来也是2000，到底是哪里出了问题