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        质粒构建之酶切位点的选择

        丁香园

        47234
        结论:一定要选择具有相同buffer的两个酶

        技术背景:

        克隆目的基因,并把其装入表达载体转化/转染原核细胞/真核细胞中,是获取目的蛋白/研究基因功能的经典方法,也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是该技术不可缺少的一部分,随着载体设计技术的发展,双酶切以其独特的优点而逐渐取代了单酶切 。

        具体实验流程如下:

        设计合成含有酶切位点,能扩增基因ORF全长的一对引物——PCR扩增目的基因——纯化PCR产物——分别对PCR产物及载体进行双酶切——分别纯化双酶切产物——连接目的基因与载体——转化大肠杆菌——筛选阳性克隆——质粒提取——转化/转染——获得重组蛋白/功能研究

        酶切反应虽然是在PCR之后,但是酶的选择却是在PCR前引物设计时就完成了。我觉得这就是错误的根源!

        故事:导师给我的第一个课题就是研究病毒包膜蛋白的功能,首先我需要克隆出该基因,并把它装入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒。根据pcDNA3.1(+)载体多克隆位点的内切酶排列顺序,在设计引物时,我在上下游引物的5'端分别引入两个常用的便宜得内切酶:BamHI/XhoI。引物送公司合成后,就开始实验:PCR过程非常顺利,一下就把目的基因拉出来了。但是怎么也想不到,这个载体我忙了半年也没有构建成功。由于PCR后面的酶切,连接,转化试验都无法进行成功性的鉴定,试验只有拿单克隆细菌进行鉴定。可是我的平板上始终看不到有单克隆生长。所以错误可能出现在PCR后的任何一个环节。

        下一步就是要找出错误发生在哪里!最容易的鉴定就是感受态细胞了,拿载体做了一个阳性对照,结果板上密布菌落。这说明感受态细胞以及转化的过程没有问题。

        那问题很有可能出在两个地方:1.双酶切没有完全切开 2.连接没有成功!由于师兄用同样的两个酶有成功的先例,所以我主观判断是连接出了问题!判断的失误导致我浪费半年的时间:购买新的T4连接酶,不停的摸索连接条件,不停的更换目的基因与载体的比例,应用平端连接的连接体系.......半年时间就在痛苦的重复和思索中过去了。老板不得已给我更换了课题!后来实验室又要构建重组质粒,由于我“经验丰富”,老板把这个重任又交给了我。这次在设计引物时,无意中我更换了酶切位点(目的序列中含有XhoI的序列,不可用),选用HindIII/BamHI。实验结果出奇的顺利,两个星期内我就把测序鉴定正确的质粒大提后交给老板!

        我反思:为什么我做了半年没做出来,而这次半月就搞定了呢,极有可能使酶切的问题:BamHI/XhoI没有共同的buffer,不管加入哪一种buffer,都有一种酶的活性只有50~70%,而HindIII/BamHI却有着共同的buffer,在双酶切体系中两个酶的活性都达到100%。

        为了证明这一设想,我又重新设计引物,选用HindIII/BamHI这两个酶,结果被我一举拿下这个重组质粒!

        之后,老板把实验室所有重组质粒的构建任务都交给了我,两年内我成功构建了8个重组质粒。

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