抗体抗原实验

制备多克隆抗体免疫动物的选择 由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同B细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高，是其独特的优点。多克隆抗体的制备是一复杂的过程为了制备高效价和高特异性的抗体，必须有理想的免疫原，挑选合适的动物和制定切实可行的免疫方案。 ...

裂合酶类(lyases) 裂合酶类(lyases)既催化一个化合物分解为2种或几种化合物又催化其逆反应由2种或几种化合物合成一种化合物的反应。反应通式：A-B↔A+B。 ⑴C-C：二磷酸果糖醛缩酶，柠檬酸合酶（Citrate synthase）。 ⑵C-O：延胡索酸（水合）酶催化反丁烯二酸+水↔L-苹果酸。 ⑶C-N：天冬氨酸酶（L-asparate ammonia ...

异构酶类(isomerase) 异构酶类(isomerase) 催化分子内的基团重排反应反应通式：A↔B。 ⑴氢的转移，如： 脯氨酸消旋酶， 醛糖-酮糖异构酶（isomerase）， 磷酸核酮糖-3-差向异构酶（epimerase）， 磷酸甘油酸变位酶（phosphomutase）事实上催化分子内的氧还反应。 ⑵顺反异构酶ELISA KIT & AN ...

饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化多克隆抗体 　【材料和试剂】　　(1)饱和硫酸铵(saturated ammonium sulfate，SAS)。　　(2)透析袋。　　(3)PBS。　　(4)高速低温离心机。　　【操作步骤】　　（1）待提取样品经4℃或室温离心13 000r/min(20000×g)，30min，收集上清；　　（2）取上清约20ml与等体积生理盐水混合后，于搅拌下缓慢滴加40ml ...

制备多克隆抗体免疫方案及免疫效价的检测 抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内等不同途径注入抗原进行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2～4周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加强免疫，每次间隔2～3周，皮下或腹腔注射加强免疫。完成免疫程 ...

DEAE-Sephadex A-50提取法纯化多克隆抗体 DEAE-Sephadex A-50(简称A-50)为弱碱性阴离子交换剂，经过NaOH处理将Cl-型转为OH-型后，可吸附酸性蛋白。γ1球蛋白属中性蛋白，等电点为pH6.85～7.5，其余均属酸性蛋白。在溶液为pH8.0时，酸性蛋白均被A-50 吸附。从而可分离纯化IgG。 1. 批量吸附法 此法可在1天内完成提取过 ...

辛酸提取法纯化多克隆抗体　 　该法可用于分离提取人、兔、小鼠血清中的Ig及杂交瘤诱生的腹水和培养上清液中McAb。　　【材料和试剂】　　（1）正辛酸。　　（2）60mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液，PBS。　　（3）透析袋。　　（4）高速低温离心机。　　【操作步骤】　　（1）将待提取样品用60mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液稀释3～4倍，调pH至4.5，对含脂质较高的标本可采用二 ...

DEAE-纤维素提取法纯化多克隆抗体 该法提取IgG简便，既可小量提取，也可大量制备。 1．批量提取法 称取DEAE-纤维素(DE32或DE52)50g，置于1000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低其离子强度。按 ...

制备单克隆抗体饲养细胞的制备与选择性培养 小鼠腹腔细胞含有巨噬细胞，除具有饲养作用外，还可清除死亡破碎细胞及微生物。取8～10周龄同系小鼠，断颈处死后，无菌操作腹腔内注射10～15ml完全培养液，用消毒拇指轻揉腹部数次后， 吸回腹腔液体，调整细胞浓度为1×105/ml。 一般一只小鼠腹腔液可获取细胞3～5×106，可供一次融合用。亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用。此外，同系小鼠脾细胞 ...

制备单克隆抗体免疫动物的选择和免疫方案 1、根据选用的骨髓瘤细胞来源选择免疫用鼠系。常用的瘤细胞来自BALB/c小鼠，因此选用6～10周龄，健康、发育良好的雄性BALB/c小鼠进行免疫。 2、免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb极为重要。一般根据抗原性质，免疫原性和小鼠的免疫反应性决定注射途径，免疫次数，间隔时间和持续时间。 【免疫方 ...

IgM的纯化 大多数IgM类抗体是优球蛋白不溶于水，故可用双蒸水透析纯化IgM。对那些溶于水的IgM类抗体可用饱和硫酸铵沉淀。沉淀后可以采用颗粒排斥层析法(凝胶过滤)进一步纯化。 颗粒排斥层析(size-exclusion chromatography)法 又称分子筛层析或凝胶过滤，是利用微孔凝胶分离不同大小分子的抗体，可用于样品中IgG和IgM的分离，常用于对硫酸铵粗提物的 ...

杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理 1975年Koehler和Milstein创建了B淋巴细胞杂交瘤技术，该技术又称之为抗体的细胞工程技术。杂交瘤技术是一项周期长，高度连续性的实验技术，涉及大量组织细胞培养，细胞免疫学和免疫化学等方法。具体包括两种亲本细胞的选择和制备；细胞融合；杂交瘤细胞的选择性培养和克隆化，单克隆抗体的制备，特异性鉴定及纯化等。制备单克隆抗体的方法有经典的和改进的方法， ...

IgA的纯化血清中IgA的含量较低，一般从乳汁中提取分泌型IgA。 【材料和试剂】（1）人初乳Xml。（2）生理盐水(NS)，HCl。（3）2mol/L Tris，0.1mol/L pH6.3 PB。（4）0.01mol/L， pH7.5(含0.1mol/L NaCl)和0.01mol/L，pH7.7(含0.25mol/L NaCl)的PB。 【操作步骤】 （1）取S ...

制备单克隆抗体骨髓瘤细胞的选择 目前可用于制备McAb的骨髓瘤细胞系较多，这些细胞经药物8-AG、5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)或6-巯基鸟嘌呤(6-TG)诱导出酶缺陷型细胞系，如缺乏次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，因为HGPRT＋细胞利用8-AG后，合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT-细胞能在含8-AG的培养液中生长，或缺乏胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和次黄嘌呤-腺嘌呤磷 ...

McAb的制备方法 1、体外培养 在细胞培养过程中杂交瘤细胞能产生和分泌McAb，但是一般产生的抗体量很少，约10～100μg/ml。近年来发展了各种新型培养技术和装置，包括用无血清培养液作悬浮培养法，中空纤维培养系统，全自动气升式或深层培养罐以及微囊或粒珠培养系统等。为了大批量生产McAb，有的公司已建成体内外结合的牛淋巴液循环法，大大提高了抗体的生产量。 2、体内诱生 ...

杂交瘤细胞的保存与复苏 目前冻存细胞均采用-196℃液氮保存，以保持其特性和活性。 1、杂交瘤细胞的冻存 收集培养的杂交瘤细胞或从小鼠体内取出的杂交瘤细胞，加入一定量的细胞冻存液(30～40％小牛血清，50～60％不完全RPMI-1640培养液，10％DMSO)，使细胞浓度为1～5×106个/ml。将细胞悬液分装到1ml冻存管中，先置于-20℃冰箱1h，再移置-80℃冰箱，最后置 ...

制备单克隆抗体骨髓瘤细胞与脾细胞的融合【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液 取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另 ...

制备单克隆抗体杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化培养 1、杂交瘤阳性克隆的筛选 杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此，必须进行筛选和克隆化。常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)，间接血凝试验(PHA)，放射免疫测定(RIA)、直接和间接荧光抗体技术(DFA、IFA)以及免疫酶斑点试验 ...

对产生抗体的细胞克隆进行分析 对产生抗体的细胞克隆，一方面检查其染色体数目，确定是否接近两种亲代细胞染色体之和(约80～100条)。另一方面，取其培养上清或诱生的腹水，检查抗体免疫球蛋白的类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量等。 1、杂交瘤细胞染色体的检查 常采用秋水仙素裂解法。 2、McAb类型、亚型的测定 通常以兔抗小鼠Ig类型和亚类的标准抗血清， ...

人-鼠嵌合抗体 人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自小(大)鼠McAb，而恒定区则来自人的抗体。这样的抗体既保持了原来McAb的特异性和亲和力，又大大减少了在人体内的免疫原性。要生产这样的嵌合抗体，第一步也是关键的一步是要从杂交瘤细胞中获得McAb的特定可变区基因，然后再与人的抗体恒定区基因连接，最后将构建好的人-鼠嵌合抗体基因导入骨髓瘤细胞中表达。主要步骤包括制备目的基因、选择载体、将目 ...