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        制备单克隆抗体骨髓瘤细胞与脾细胞的融合

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        制备单克隆抗体骨髓瘤细胞与脾细胞的融合
         
        【材料和试剂】
            (1)骨髓瘤细胞悬液  选好骨髓瘤细胞株,取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞,制备细胞悬液。
            (2)免疫小鼠脾细胞悬液  取3天前加强免疫的小鼠,眼眶放血,分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3~5min。无菌操作取出脾脏,置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤,剪去周围的结缔组织,将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上,先用剪刀剪成3~5个小块,然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中,加不完全培养液50ml,1000r/min离心5min,弃上清,再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中,计活细胞数,一般一只小鼠可得0.5~2×108 个脾细胞。
            (3)饲养细胞,HAT培养基,24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。
         
        【操作步骤】 
            (1)将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:5~1:10比例混合,加入20~50ml RPMI-1640液,1000r/min×10min离心弃上清,用手指轻轻击打离心管底部,使沉淀细胞分散,将离心管置37℃水浴中。
            (2)吸取1ml37℃预温的50%PEG缓慢滴入离心管内,1min内加完。37℃静置1~5min。
            (3)在5min内滴加不完全完全培养液(37℃预温)20ml,第一分钟内滴加1ml,第2分钟2ml,第3分钟5ml,第4和第5分钟各6ml,同时应边加边轻轻地转动离心管,应沿管壁滴加,不应直接滴加在沉淀细胞上,以防将刚融合的细胞冲开。然后加1640液至50ml使PEG作用终止。
            (4)800r/min×5~10min离心弃上清,将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养液中,接种24孔或96孔培养板。接种完毕后,将培养板放入37℃ 5%CO2 温箱中培养。
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