制备单克隆抗体饲养细胞的制备与选择性培养
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制备单克隆抗体饲养细胞的制备与选择性培养
小鼠腹腔细胞含有巨噬细胞，除具有饲养作用外，还可清除死亡破碎细胞及微生物。取8～10周龄同系小鼠，断颈处死后，无菌操作腹腔内注射10～15ml完全培养液，用消毒拇指轻揉腹部数次后， 吸回腹腔液体，调整细胞浓度为1×105 /ml。 一般一只小鼠腹腔液可获取细胞3～5×106 ，可供一次融合用。亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用。此外，同系小鼠脾细胞和胸腺细胞亦可作为饲养细胞。
选择性培养 两种亲本细胞经PEG处理后，可形成多种细胞成分的混合体，包括未融合的游离亲本细胞、骨髓瘤细胞间的融合、免疫B细胞间的融合以及骨髓瘤细胞与免疫B细胞间融合的异核细胞，仅后者可形成杂交瘤，应予以筛选出来克隆培养。通常应用HAT培养液，其中含有次黄嘌呤H、氨基喋呤A和胸腺嘧啶核苷T。
大多数实验室在融合当天就加入HAT培养液，也可次日加入。一般在融合后7～14天内使用HAT培养液，然后改用HT培养液。融合后第2～3周进行换液，每次吸出培养孔旧液1/2换入新液，以后视克隆生长情况3～5天换液1次，连续2周。3～5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增殖，当集落>3mm或布满孔底1/2时即可取上清作抗体活性检测，同时补加新鲜HT培养液。在一次较好的融合试验中，约70～80％孔有克隆生长。所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。培养3周后即可改用普通完全培养液。
