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        DEAE-Sephadex A-50提取法纯化多克隆抗体

        互联网

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        DEAE-Sephadex A-50 提取法纯化多克隆抗体
         
            DEAE-Sephadex A-50(简称A-50)为弱碱性阴离子交换剂,经过NaOH处理将Cl- 型转为OH- 型后,可吸附酸性蛋白。γ1球蛋白属中性蛋白,等电点为pH6.85~7.5,其余均属酸性蛋白。在溶液为pH8.0时,酸性蛋白均被A-50 吸附。从而可分离纯化IgG。
         
            1. 批量吸附法
            此法可在1天内完成提取过程,纯化前后样品体积变化不大,所得IgG无变性现象,抗体效价亦无明显降低。制品可达PAGE及免疫电泳纯。适用于提纯人、羊、兔等血清中的IgG。
         
            【材料和试剂】
            (1)DEAE-Sephadex A-50。
            (2)PB缓冲液:0.01mol/L,pH6.5 Na2 HPO4 -NaH2 PO4 缓冲液。
         
            【操作步骤】
            (1)A-50的预处理:称取4~6g A-50悬浮于500~1000ml蒸馏水中,1h后倾去上层细粒。然后将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液(60~100ml)中,搅拌后静置30min,以蒸馏水洗至中性,再用0.1mol/L NaH2 PO4 同上操作过程处理,蒸馏水洗至中性。最后用0.01mol/L,pH6.5 Na2 HPO4 -NaH2 PO4 缓冲液(PB)平衡,减压抽干,保存备用。
         
            (2)吸附提取:取15ml血清加等量0.01mol/L,pH6.5 PB稀释至30ml(也可不稀释),加入1/4体积滤干的DEAE-Sephadex A-50(相当于干重1g)混合。室温(或4℃)浸泡1 h后过滤,收集滤液。再加入同样体积的DEAE-Sephadex A-50重复上述处理过程共3次,亦可在血清内加入过量DEAE-Sephadex A-50吸附处理一次。收集滤液合并,即为提纯的IgG制品。或再透析去盐,浓缩、冻干保存备用。
         
              2.A-50柱层析法
             【材料和试剂】
             (1)DEAE-Sephadex A-50。
             (2)待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
             (3)1.5×50cm 层析柱;透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
             (4)PB缓冲液:0.1mol/L,pH7.4 Na2 HPO4 -NaH2 PO4 缓冲液。
         
             【操作步骤】
             (1)A-50经酸碱处理,平衡至中性后,浸泡于0.1mol/L,pH7.4 PB中,置4℃冰箱储存备用。
             (2)装柱:同DE52。
             (3)平衡:松开出水口螺旋夹,以PB平衡,控制流速为15滴/min,待洗脱液与流出液之pH值达到一致时,停止平衡。
             (4)加样、洗脱、收集与浓缩:基本上同DE52,以0.1mol/L PB洗脱。
        用过的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2 HPO4 洗脱回收。洗至流出液中无蛋白(OD280nm<0.04)后再用蒸馏水洗至中性,加入0.02%叠氮钠于4℃保存备用。 
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