蛋白质技术

xiayuxue 请教大家：我检测的是两种细胞(一种是正常细胞，一种是肿瘤细胞）中某个分子的表达，PCR检测的基因表达量一样多，而蛋白水平却不一样多，有这种可能吗？就是检测的本底表达，未加处理因素xiayuxue 没有人知道吗？bigbang_0_0 完全有这种可能，mRNA的量的改变不能代表蛋白的量的改变，从mRNA到蛋白，还涉及到翻译和翻译后修饰（包括决定蛋白质稳定性的翻译后修饰）等过程，而这些过程在癌变细胞中都是有可能发 ...

lxqsh 请教大家，以下是本人跑的WB结果图。本人不明白那一团黑的是什么回事，跟右边那个条带都不是一回事儿？如果是表达太强的话，那也最起码应该是很黑很粗类似线样的条带吧，可是我跑出来的结果就是整个泳道都是黑的。用同样的蛋白重跑了一次还是这个结果，请问是不是我的细胞或者是蛋白有问题呢？或者是还可能有什么其他的原因呢？多多指教，不胜感激！dlzhangyu 是不是忘记煮蛋白了？lxqsh 没有，所有蛋白都是统一变性的。dlz ...

zhuhuachao 请问各位战友， western-blot法测得的结果是你所要检测蛋白的总蛋白还是只包括游离的蛋白？或者说该目标蛋白与其他蛋白结合以后，western-blot法结果上是否有所反应？amygdala 一般来说，western blot检测到的是包括游离态和聚合态的总蛋白，目标蛋白与其他蛋白结合的情况下也能检测出来。能否检测取决于抗体的识别位点是否存在，通常情况下目标蛋白的抗体识别位点不会受其形成复合物影 ...

prince1101 非磷酸化抗体是识别总得蛋白的，比如AKT。P-AKT和AKT其实只差一些磷酸基，分子量稍大点，以前听别人讲P-AKT和AKT之间有shift，有时候WB是可以做出来的。用的是梯度胶？分子量在68KD左右。应该怎么样来配胶呢？梯度胶的浓度？谢谢！prince1101 希望高手能赐教！ourlab 某些 AKT抗体，如cell signaling, #9272, 不能识别磷酸化AKT，只能识别非磷酸化AKT。所以，最好用磷酸化 ...

liteng1117 求助:构建好了重组腺病毒进行蛋白表达，分子量是14kd，5%的浓缩胶70v，12%，或15%的分离胶110v，跑90min。湿转：100v，90min。封闭用5%的脱脂奶粉，封闭3h（因为背景深，以为封闭久会好些）。一抗1:3000，4度过夜，二抗1:5000，孵育1h，洗膜都是用TBST漂洗15min ×4次。但是显影后背景特别深，虽然可以看见目的条带，但还是有一些非特异性的条带出现，不知道是封闭出问题还是一 ...

已寒 各位前辈，我现在做western，NF-kB的总是出现2条带，有人说有一条是非特异性着色，但我发现两条带之间关系很密切，请看图，不同处理组的两条带中，一条升高则另一条会降低，存在这种关联性，请高手指点。sunnyun 楼主两条带是在目的条带位置处吗？我最近也做p65出来两条带，但都比目的条带小，不知道是不是降解了，我用的老鼠肝脏组织，有一个多月了，保存在-80度冰箱，楼主帮忙分析看看有没有降解的可能啊？snowden0 ...

xiayuxue 请问小分量的蛋白比如14KD,用三抗是不是更好？xiayuxue 用 三抗有什么优势啊？请大家帮帮忙，wb怎么也做不出来小分子量的roy2929 三抗一般就是放大信号吧做不出来的原因很多啊 不说详细点不好讲xiayuxue 我就是想请教大家，在什么情况下才用三抗？ronaldo_zj 楼主您好！我也做过小分子量的蛋白，大概是15kD左右吧，我没有三抗，我自己的经验是：1. 电泳的时间一定不要太长，我把积层胶制的很厚，分离胶比 ...

anlise 刚做的western，跑分离胶时发现mark的条带被拖长了，原来的线性条带变成了长方形。考虑哪些方面的原因呢？selleckchemcials 1. 可能是电流太强了， 可以考虑把电压调低一点~2. 分离胶浓度有点低，可以考虑把换成高浓度的胶~做实验的时候，为了得到漂亮的图，一定不要介意多花时间~我有的时候为了让条带好看，170KD的蛋白都用12%的胶，跑上3小时呢~当然也可能是marker质量不好，还是果断换掉比较好~ ...

夜色星辰1234 我是一个新手， western前后做了两次，均是在130-150之间出现信号很强的非特异性条带，另有少许杂带，而B-actin处信号很弱（原则上说，应在膜的中下近1/3处出现特异性条带），但却几乎看不出来（下图所示），请高手指点，不胜感激！aids610610 上样量一样吗？夜色星辰1234 aids610610 wrote:上样量一样吗？上样体积均是20ul,蛋白定量均是45ug.每次上样之前均先在沸水中煮了5min, ...

zhangyuxianggx 各位western达人，本人在western操作中屡次失败，现有几个问题跟达人们请教一下：1、我的蛋白是96kDa,选择8%的分离胶有没有问题？2、配制浓缩胶我用的是0.5M Tris-HCL(PH=6.8)，但是看到好多配方用的都是1.0MTris-HCL(PH=6.8)，这个有没有什么影响？3、转膜是用的300mA,40min，看着转膜后胶很干净，就一直用的这个电流和时间。但是最后膜上总是很乱，背景高 ...

dongfangzhizi06 我要做信号通路(ERK和p38)，请问多少数量的细胞可以提磷酸化蛋白做western blot检测p-ERK1/2和p-p38？六孔板的一个孔够吗？谢谢！民间恺撒 上次我接板时的密度是5×105，提了四个孔的总蛋白，大概浓度在8.5左右。建议6孔板可以使用两个孔叠加在一起，这样蛋白浓度会有所保证。bianbenjamin 我都是六孔板一个孔做的，为了保证蛋白浓度，少加点裂解液即可，我一般是60-80微 ...

lixingliang1987 我的实验流程是：先扩增带有Flag标签的基因，再转进293T细胞进行表达，然后做western验证蛋白表达情况，但是发光后却出来好几条条带，十分困惑，请大家帮忙看看，图片附上。第一幅图是内参GAPDH，第二幅图是我的目的蛋白。lixingliang1987 自己顶一下BioGao 一抗孵育有问题吧。。。本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师 ...

liuxing0626 各位学长好：我买的ProteinTECH公司的 ERK1 抗体 western blot 条带有两条，公司的说明书也是两条，请问这是个怎么情况？而且我要做ERK1/2。但是ERK2也是单买的，混起来用的话会不会出来3条带了。ERK1产品地址http://www.ptglab.com/Products/ERK1-Antibody-11257-1-AP.htmliuxing0626 123药尊 是一条比较深吧。想完全没有第二条带， ...

zhywang4072 鄙人现在做一180KD的蛋白，之前转PVDF膜用的是100v两个半小时，预染marker转得很漂亮，内参也很不错，但是目标蛋白条带却没有，请教各位大侠，这是什么原因？还有诸位大蛋白转膜时候条件怎样？我用的是湿转，谢谢wodezxn 我觉得100V2h肯定是足够了，没转上应该是你目的蛋白的问题，可能是蛋白表达量太少或者你提蛋白的时间有问题。zhibinx2007 350 mA恒流转2小时就足够了，目标条 ...

llh刘丽华 请教高手我最近做western blot，结果总是不理想，目的条带总是很淡，上样量已经是60ug了，封闭用的是5%脱脂奶粉，我还应该怎么改进哦？下面是我的结果，采用的是ECL化学发光，凝胶成像系统拍照，下面一条是我的目的条带。 麻烦各位帮帮忙吧！Mostino 转膜应充分，并提高第一抗体的使用量！成其瑞 用好点的抗体volano 我觉得你首先应拿一个别人已经做过western blot证实条带条件好的蛋白样本来做对比，排除你 ...

毛毛虫0118 我想用人血标本做WB，请问血标本最多可以放多久啊？还有做WB的话，要收集大概多少毫升血就可以了呢？毛毛虫0118 为什么没有人回复我啊？volano 建议你还是自己摸索一个量首先，不知道你要做的目的蛋白是什么？分子量有多大？是不是容易降解？如果分子量大，不容易降解，那可以储存比较长时间，如果你的目的蛋白是小蛋白那就是越新鲜越好吧，我看过师姐做的12KD蛋白，样本稍微放长些时间就悲催了其次，western blo ...

llh刘丽华 各位好：我做了1个多月western blot了，内参跑得还可以，但是目的蛋白总是跑不好，今天跑出来非特异性条带很清楚，而目的条带却很淡，不知是什么原因！前一次也是这种情况，我就延长封闭时间至2h，一抗1:700，二抗1:5000，请各位高手帮忙分析一下吧！下面是我的图片，最下面，模糊的一条（靠图片中间的一条）是我的目的条带！coffeeshine 如果非特异带很清楚，延长封闭时间没作用。你的目的蛋白和一抗的关系是 ...

suiyuanjiuzhu 转染的话不就改变了细胞本来的表达量了吗xujian2004265 你不是要检测你的外源基因的表达吗？加我QQ24289096suiyuanjiuzhu 老板一定要我做蛋白 把mRNA让另一个人做了郁闷啊本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

心灵交流 本人想请教高手：在westernblot中煮样时需不需加上loading buffer后再煮样？以及loadingbuffer和样加的比例如何定？如6Xloadingbuffer加到样中的量如何定？谢谢zhong_cq 那是要加LOADING BUFFER, 6X的上样缓冲液，那样本与BUFFER之比为5：1（V/V）。coffeeshine 和做SDS-PAGE一样，加多大浓度、多少量的上样缓冲液视样品的浓度而定。selle ...

glacierna6 如果是做western blot，有个电转的过程，蛋白可以和NC膜比较牢固的结合。但是如果我前面步骤都不做，直接点二抗到NC膜上呢，放置10分钟，能否牢固结合？如果加封闭液，用摇床晃或者不晃，会不会把二抗从膜上晃下来（假设是没有饱和结合的）？谢谢高人指点！shb-sangon 直接点二抗到NC膜上(膜下放置滤纸），放置10分钟，自然风干，能牢固结合。用无蛋白封闭液（PW040），用摇床轻晃，不会把二抗从膜上晃下 ...