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        【讨论】关于western blot实验的一些问题

        丁香园论坛

        2069
        各位western达人,本人在western操作中屡次失败,现有几个问题跟达人们请教一下:
        1、我的蛋白是96kDa,选择8%的分离胶有没有问题?
        2、配制浓缩胶我用的是0.5M Tris-HCL(PH=6.8),但是看到好多配方用的都是1.0MTris-HCL(PH=6.8),这个有没有什么影响?
        3、转膜是用的300mA,40min,看着转膜后胶很干净,就一直用的这个电流和时间。但是最后膜上总是很乱,背景高,也有好多小点,不知是不是转膜没转好?
        4、我的一抗原液是用含2%蔗糖的PBS配的,是不是就应该用这种PBS稀释使用呢?
        5、用封闭液稀释抗体的话,抗体能重复利用多少次?担心封闭液中的蛋白容易污染抗体。
        1,没有问题
        2,没有问题,重要的是你的终浓度,而不是母液浓度
        3,湿式?可以稍微延长一下转膜时间,要保持低温,把槽子埋在冰里或放冷柜里
        4,用封闭液就可以,加0.3%的叠氮钠
        5,取决于抗体,抗体好的话至少5,6次总可以
        首先感谢2楼的回复。但是还想问一下,封闭时加0.3%的叠氮钠目的是什么呢?我从来没加过,并且抗体都是用TBST稀释的,不知是不是有影响?
        我前几次做的膜是孵的荧光二抗,到Odesay上看结果时,背景总是很杂乱,一片红红绿绿的,还有很多杂点,找不出是什么原因

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        【讨论】关于western blot实验的一些问题

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