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        【求助】180KD的膜蛋白western转膜条件怎样?(湿转)

        丁香园论坛

        6800
        鄙人现在做一180KD的蛋白,之前转PVDF膜用的是100v两个半小时,预染marker转得很漂亮,内参也很不错,但是目标蛋白条带却没有,请教各位大侠,这是什么原因?还有诸位大蛋白转膜时候条件怎样?我用的是湿转,谢谢
        我觉得100V2h肯定是足够了,没转上应该是你目的蛋白的问题,可能是蛋白表达量太少或者你提蛋白的时间有问题。
        350 mA恒流转2小时就足够了,目标条带没有有很多原因,比如会不会是抗体问题等。
        第一考虑表达量的情况。建议测量标本中的含量。
        第二考虑抗体的问题。
        用的是细胞株,一抗用的是CST的,说明书上面图倒是还不错,链接的已发表文章图也不错,之前有两次WB目的蛋白倒是出了条带,不强,而且个别细胞株分为两层条带,但是当时背景没有洗干净,最近一次背景洗干净了,目的蛋白也没有了,之前看到的会不会是降解的或者杂质?
        可能是降解的或者杂质
        100v 2h
        可以看看抗体的抗原表位是不是和你的目标蛋白一致,如果抗体特异性没有问题,也许是目标蛋白表达量比较低,可以试试加大上样量,做几个浓度梯度看看。
        一般我都是60v过夜湿转,同样180kd的EGFR结果很好,对于这种分子量较大的蛋白我都是过夜的,还有用百分之八或十的胶来跑电泳,如果还是不出结果就要考虑抗体了
        是否考虑了PVDF膜的孔径?(0.22 or 0.45?)

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        【求助】180KD的膜蛋白western转膜条件怎样?(湿转)

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