【求助】做western时，非特异性条带信号很强，但B-actin信号很弱！

我是一个新手， western前后做了两次，均是在130-150之间出现信号很强的非特异性条带，另有少许杂带，而B-actin处信号很弱（原则上说，应在膜的中下近1/3处出现特异性条带），但却几乎看不出来（下图所示），请高手指点，不胜感激！

上样量一样吗？

上样体积均是20ul,蛋白定量均是45ug.每次上样之前均先在沸水中煮了5min,同一瓶抗体，师姐做出来了，不过有杂带！我们俩的各个步骤的设置条件差不多！
请问：煮沸后离心的具体目的是什么？有时间与速度的具体要求吗？还是只需快速离心即可？？！！谢谢！
因原因不明，我今天从组织匀浆起重新做了一次，明天显影，再看一下结果如何！！

之前用的是注射器，抽取样品位置不对，所以出现杂带！这次采用老师的意见，换用移液枪上的样，（个人为比较期间，两空仍用注射器）差别很明显，用移液枪的杂带没有了！！很开心！ 个人总结：western该注意的事项很多。都做到了，结果应该没问题！