小分子量WB怎么做？
丁香园论坛
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请问小分量的蛋白比如14KD,用三抗是不是更好？
用 三抗有什么优势啊？请大家帮帮忙，wb怎么也做不出来小分子量的
三抗一般就是放大信号吧
做不出来的原因很多啊 不说详细点不好讲
做不出来的原因很多啊 不说详细点不好讲
我就是想请教大家，在什么情况下才用三抗？
楼主您好！
我也做过小分子量的蛋白，大概是15kD左右吧，我没有三抗，我自己的经验是：
1. 电泳的时间一定不要太长，我把积层胶制的很厚，分离胶比平常的要短一些，我用的是15%的分离胶，大概跑了2/3分离胶左右的时候就停了；
2. 转膜我们是湿转，时间我控制在6小时左右，恒压25-27V左右；
3. 小分子量蛋白有时候会被marker的不准确而影响判断，我一般是用两种不一样的marker加在两边，来综合判断分子量，这样更准确；
4. 最后就是抗体了，我通过更换了好几种抗体才成功的，更换效价更高的单抗，这点我认为极为重要，因为本来小分子量的蛋白就很容易弥散，即使上样量很大，抗体浓度很高有时候都很难出来，建议使用高质量的一抗，有条件的设立一个阳性对照组；
5. 当时我是压片子显影的，我直接压了15分钟，呵呵，反正每一步都得改善吧。
希望对楼主有帮助，大家共同讨论。
我也做过小分子量的蛋白，大概是15kD左右吧，我没有三抗，我自己的经验是：
1. 电泳的时间一定不要太长，我把积层胶制的很厚，分离胶比平常的要短一些，我用的是15%的分离胶，大概跑了2/3分离胶左右的时候就停了；
2. 转膜我们是湿转，时间我控制在6小时左右，恒压25-27V左右；
3. 小分子量蛋白有时候会被marker的不准确而影响判断，我一般是用两种不一样的marker加在两边，来综合判断分子量，这样更准确；
4. 最后就是抗体了，我通过更换了好几种抗体才成功的，更换效价更高的单抗，这点我认为极为重要，因为本来小分子量的蛋白就很容易弥散，即使上样量很大，抗体浓度很高有时候都很难出来，建议使用高质量的一抗，有条件的设立一个阳性对照组；
5. 当时我是压片子显影的，我直接压了15分钟，呵呵，反正每一步都得改善吧。
希望对楼主有帮助，大家共同讨论。
[来自丁香园WAP]
关于转膜应该是关键，6小时有点太久了，有没有快点的方法？
关于转膜应该是关键，6小时有点太久了，有没有快点的方法？
低电压，跑一半，半干转用50伏，20分钟。还有，最重要的，你蛋白浓度可能太低。
我经常做小分子量的背景很深
不知道要如何改进啊~~~~~
不知道要如何改进啊~~~~~
槐北路 wrote:
低电压，跑一半，半干转用50伏，20分钟。还有，最重要的，你蛋白浓度可能太低。
没用过半干转，湿转的话，转多久呢？
6小时太久了吧
我也是14左右的分子量，湿转300mA请问多久合适？谢谢~
这个好贴，学习中
圈圈不圆 wrote:
我也是14左右的分子量，湿转300mA请问多久合适？谢谢~
ronaldo_zj
楼主您好！
我也做过小分子量的蛋白，大概是15kD左右吧，我没有三抗，我自己的经验是：
1. 电泳的时间一定不要太长，我把积层胶制的很厚，分离胶比平常的要短一些，我用的是15%的分离胶，大概跑了2/3分离胶左右的时候就停了；
2. 转膜我们是湿转，时间我控制在6小时左右，恒压25-27V左右；
3. 小分子量蛋白有时候会被marker的不准确而影响判断，我一般是用两种不一样的marker加在两边，来综合判断分子量，这样更准确；
4. 最后就是抗体了，我通过更换了好几种抗体才成功的，更换效价更高的单抗，这点我认为极为重要，因为本来小分子量的蛋白就很容易弥散，即使上样量很大，抗体浓度很高有时候都很难出来，建议使用高质量的一抗，有条件的设立一个阳性对照组；
5. 当时我是压片子显影的，我直接压了15分钟，呵呵，反正每一步都得改善吧。
希望对楼主有帮助，大家共同讨论。
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