动物组织/细胞RNA提取试剂盒，阿拉丁

　本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细 胞及组织中高效提取总RNA。起始样本一般最多30 mg组织或1 x 107细胞。本试剂盒 还可回收未完全纯化的RNA、体外转录和酶促反应后得到的RNA。用本试剂盒可提取 纯化分子量大于200碱基的高品质RNA，几乎无DNA残留。如果要进行对微量DNA非 常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase I在柱上进行消化去除。提 取的RNA可用于RT-PCR、Nothern Blot、Dot Blot等下游实验。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）。 

实验前准备及重要注意事项 

1．预防RNase污染，应注意以下几方面： 

1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。 

2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸 泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。 

3）配制溶液应使用无RNase的水。 

4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。 

2．提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。 

3．使用前请检查Buffer RL是否出现结晶或者沉淀，可置于56℃加热重新溶液。Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为1%。如1ml Buffer RL加10μl β-巯基乙 醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。 

4．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。 

5．所有离心步骤如无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。 

6．若下游实验对DNA非常敏感，建议用不含RNase的DNase I对 RNA进行处理。

操作步骤 

1．样品处理 

1a 组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600 μl Buffer RL（使用前检查 是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20 mg加350 μl Buffer RL。样品体积不超过 Buffer RL体积的十分之一。 

1b 单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉 淀，弃上清，每6-10 cm2 培养面积加入600 μl Buffer RL，小于6 cm2 加入350 μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。 

1c 细胞悬液：12,000 rpm（～13,400×g）离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每 5×106 -1×107 细胞加入600 μl Buffer RL，少于5×106 细胞加入350 μl Buffer RL，反 复吹打几次，使其充分裂解。 

注意：

1）尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA产量。 

2）尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。 

2．样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。 

3．12,000rpm离心2-5 min，取上清进行下步操作。 

4．加入1倍体积（600 μl或350 μl）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。 

注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。 

5．将步骤4所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns RM）中，若一 次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱放回收集管中。 注意：吸附柱的最大载量为100 µg不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。 

6． 向吸附柱中加入700 μl Buffer RW1, 12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放回收集管中。 

可选步骤：如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，则用以下步骤替代步骤6。 

1）向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新 放回收集管中。 

2）配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I (1 U/μl)，混匀，配制成终体积为80 μl的反应液。 

注意: 以上体系为按照我公司产品DNase I 反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。  

3）向吸附柱中直接加入80 µl 配制好的DNase I 反应液，20-30℃孵育15分钟。 

4）向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新 放回收集管中。 

7．向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离 心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。 

8．重复步骤7。 

9．12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。 

10.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃ 保存RNA，防止降解。 

注意：

1）RNase-Free Wate体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 

2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤10。 

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤10。