实战案例：将一段长度 1500bp 的 OR F序列克隆至 pcDNA3.1+载体用于蛋白表达

1. 从 cDNA 模板中扩增目的基因并添加同源重组臂

设计带有同源重组臂的序列进行 PCR 扩增：

上游引物：TAGCGTTTAAACTTAAGCTT+ATGXXXX（前 20 个碱基为载体上的同源重组臂，ATG 是起始密码子）

下游引物：ACGGGCCCTCTAGACTCGAG+TTAXXX（前 20 个碱基为载体上的同源重组臂，TTA 是终止密码子对应的序列）

PCR 反应体系：

组分	用量（50ul 体系）
AllTaq Master Mix，4×	12.5ul
上游引物（浓度 10uM）	1.2ul
下游引物（浓度 10uM）	1.2ul
模板 cDNA	0.1pg-1ug
无酶水	补齐至 50ul

PCR 程序：

步骤	温度	时间
预变性	95℃	2 min
变性	95℃	5s
退火	55℃（根据需要可调整）	15s
延伸	72℃	10s

后三个步骤循环 35-40 次

注：如果引物扩增效率偏低，可以先根据目的基因的序列设计特异性引物，从 cDNA 中扩增目的基因片段，然后再以回收片段为模板，用带有同源臂序列的引物进行扩增，获得的片段用于构建载体。

2.pcDNA3.1+载体使用 HindIII 和 XhoI 进行双酶切

组分	用量
质粒载体	1ug
HindIII 酶	1ul
XhoI 酶	1ul
Buffer	两种酶兼容缓冲液（如 CutSmart Buffer 10×，添加 5ul）
无核酸酶水	补齐至 50ul

37℃ 酶切 1 h

3. 琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增的目的片段及线性化载体

配置新鲜的 1×TAE 电泳缓冲液，配置 1% 浓度的琼脂糖凝胶用于电泳，电泳强度不超过 5V/cm，电泳时间根据条带迁移的情况而定，一般 30 分钟左右。

4. 胶回收纯化线性化质粒及 PCR 扩增片段

切胶回收目标 PCR 产物条带和线性化质粒条带，回收流程参考如下：

切胶称重加入 buffer QG	BufferQG 按照胶 3 倍体积添加（100 mg 胶≈100ul）
溶胶	50℃ 温浴 10 min，间隔摇晃混匀，如果颜色变紫色，可以添加 10ul 3M 的醋酸钠调节 pH 至颜色变为黄色
加异丙醇	加入一倍胶体积的异丙醇，混匀
纯化柱纯化	溶液加入 QIAquick 纯化柱，离心，弃滤液或真空吸滤液
漂洗	加入 750ul Buffer PE 至纯化柱，离心弃滤液
洗脱	加入 50ul buffer EB 或者无核酸酶水，离心收集滤液

回收 PCR 产物和线性化质粒进行 Nanodrop 或取微量进行琼脂糖凝胶电泳来检测回收 DNA 的质量。

5. 目的片段及线性化质粒进行同源重组

组分	用量
线性化载体	约 100ng 可根据重组酶说明书建议调整
目的片段	约 80ng 可根据重组酶说明书建议调整
5×重组 buffer	4ul
重组酶	2ul 或根据重组酶说明书建议调整
无核酸酶水	添加至 20ul

冰上配置体系，后于 37℃ 孵育 30 min 后冰上冷却备用。

6. 连接产物转化大肠杆菌

取大肠杆菌感受态 DH5α	冰上解冻
连接产物转化	10ul 连接产物冰上加入 100ul 感受态细胞，混匀孵育 30 min
热激	42℃ 热激 45s-90s，迅速冰上冷却 3 min
复苏	加入 900ul 液体 LB 无抗培养基，37℃，200rpm，1 h
涂板	低速离心，弃 800ul 培养基，剩余培养基重悬菌体涂板
培养	37℃ 倒置培养皿培养 12-16 h

 

7. 大肠杆菌培养及挑选单克隆菌落

挑选大小正常，表面光滑圆润的单克隆至液体 LB 培养基（含氨苄抗生素）中培养，37℃，200rpm，培养，菌液浑浊后即可取 1ul 菌液用于 PCR 鉴定，其余菌液可继续培养至 12 h。

8. 单克隆菌 PCR 鉴定

参考前文的 PCR 反应体系和程序，检测引物可以使用特异性引物或者载体上的通用测序引物，或者一条特异性引物加一条测序引物。如果单克隆为阳性，可以在琼脂糖凝胶电泳检测时，看到单一明亮的条带。如果条带大小与预期不符，或者无条带，条带过弱，均为假阳性克隆，则丢弃对应的菌液。

9. 质粒小提及测序鉴定

质粒小提可参考如下操作流程：

菌体收集	2 ml 菌液 8000rpm 室温离心 3 min，弃上清
菌体重悬	收集的菌体加 250ul 溶液 P1，重悬混匀
菌体裂解	加入 250ul 溶液 P2，轻柔上下颠倒混匀至溶液澄清
溶液中和	加入 350ul 溶液 N3，轻柔上下颠倒混匀至出现白色沉淀
离心沉淀	室温下 13000rpm 离心 10 min，沉淀积于离心管底部
过纯化柱	去上清液加入纯化柱，13000rpm 离心 30s 弃上清
去除蛋白	加入 0.5 ml 的溶液 PB 漂洗纯化柱，13000rpm 离心 30s 弃上清
漂洗质粒	加入 0.75 ml 的溶液 PE 漂洗纯化柱，13000rpm 离心 30s 弃上清
去除乙醇	13000rpm 离心 60s，去除膜上残留的漂洗液、乙醇等杂质
洗脱质粒	向膜中心加入 50ul 的 buffer EB 或无核酸酶水，孵育 1 min，13000rpm 离心 1 min，洗脱质粒

注：
1. 溶液 P1 在使用之前要加入 RNase A，并且加入 RNase A 后需要将其保存于 4℃；

2. 在溶液 P1 中，如果添加了 LyseBlue 颜色指示剂，在 P2 加入后，颜色变蓝色，N3 加入后，颜色变澄清无色；

3. 去蛋白液 Buffer PB 一般在使用的感受态细胞是 endA+基因型时需要加入，用于去除残留较多的核酸酶；

4. 漂洗缓冲液 PE 在使用之前要按照比例添加酒精；

5. 为提高洗脱效率，buffer EB 或者无核酸酶水洗脱质粒之前可以温浴至 65℃ 再加入到硅胶膜中心用于洗脱质粒。

 

内容来源：QIAGEN 凯杰