质粒的制备

1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床——250 r/min过夜培养；3.吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；4.加入300 ml溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；5.加入

质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因。在研究基因功能时，无论是过表达，还是基因敲除，我们都需要通过 PCR 构建载体，然后转导到大肠杆菌；摇菌扩增后，从细菌中提取质粒，从而用于后续分子或细胞实验。

1. 从 cDNA 模板中扩增目的基因并添加同源重组臂设计带有同源重组臂的序列进行 PCR 扩增：上游引物：TAGCGTTTAAACTTAAGCTT+ATGXXXX（前 20 个碱基为载体上的同源重组臂，ATG 是起始密码子）下游引物：ACGGGCCCTCTAGACTCGAG+TTAXXX（前 20 个碱基为载体上的同源重组臂，TTA 是终止密码子对应的序列）PCR 反应体系：组分用量（50ul

尽管现在很多一步法构建载体的试剂盒说明书中都提到可以使用 PCR 产物直接进行连接，不需要进行胶回收纯化，但是在有些情况下，体系中的杂质会降低片段与载体的连接效率。对于难以连接的片段，纯化后的连接效率会大大提高。