DNA 片段回收纯化通用

尽管现在很多一步法构建载体的试剂盒说明书中都提到可以使用 PCR 产物直接进行连接，不需要进行胶回收纯化，但是在有些情况下，体系中的杂质会降低片段与载体的连接效率。对于难以连接的片段，纯化后的连接效率会大大提高。

与基因组 DNA 纯化或质粒 DNA 纯化类似，从琼脂糖凝胶中或 PCR 体系、酶切体系中回收纯化 DNA 也可以使用硅胶膜纯化技术来进行纯化。片段 DNA 可以被硅胶膜选择性吸附，并且在高盐缓冲液下漂洗去除杂质，并使用低盐缓冲液进行洗脱。

实验开始前准备工作：

将 96-100% 乙醇加入到 PE 缓冲液中；

所有离心步骤均在微量离心机中以 17,900 x g（13,000 rpm）的速度进行；

以电泳后的凝胶样品为例：

1) 取洁净、锋利的刀片将 DNA 目的片段从琼脂糖凝胶上切下，转移凝胶至一透明干净的 EP 管中；

2) 对含有凝胶切块的 EP 管进行称量，加入 3 倍体积的 QG Buffer (eg：100 mg 凝胶~100uL，所以加入 300 μl QG Buffer)（注意：对于＞2% 的凝胶，加入 6 倍体积的 QG Buffer）;

3)50℃ 孵育 10 min(或者至到凝胶融化)，期间每 2~3 min 用震荡涡旋仪震荡一次以帮助溶解凝胶（如果混合物的颜色为橙色或紫色，则加入 10μl 3M 乙酸钠，pH 5.0，并混合，混合物变黄）;

4) 向样品中加入 1 凝胶体积的异丙醇并混合;

5) 将硅胶模纯化柱放入提供的 2 ml 收集管，随后将样用移液枪转移到 硅胶模纯化柱上并离心 1 分钟；弃掉流出液，将硅胶模纯化柱放回同一管中。如果样品体积 >800 μl，可按照该步骤再次操作一遍；

6) 洗涤，将 750 μl PE 缓冲液添加到硅胶模纯化柱中并离心 1 分钟；丢弃流出液，将硅胶模纯化柱放回同一管；

7) 将硅胶模纯化柱放入干净的 1.5 ml 微量离心管中；

8) 洗脱，加入 50 μl EB 缓冲液（10 mM Tris·Cl，pH 8.5）或无酶水到硅胶模纯化柱膜中心，静置 1 分钟；

9) 用干净的 1.5 ml 或 2 ml 无菌离心管收集纯化后的片段 DNA，后续 DNA 可保存在-20℃；

a. 每种胶回收试剂盒中回收柱的承载量有限，避免胶块过大超过回收柱承载量，导致 DNA 回收率效率低；

b. 切胶时紫外照射时间过长，容易导致 DNA 片段断裂，损伤的 DNA 难以与回收柱结合，导致效率下降。解决方案：尽量使用 302nm 长波长紫外灯（对 DNA 损伤小），并缩短照射时间（从切胶到放入溶胶 buffer 控制在 30 秒内），或使用蓝光染料及蓝光切胶仪；

c. 琼脂糖凝胶浓度不合适会导致 DNA 回收效率低：凝胶浓度过高（如 > 2%）会导致 DNA 片段嵌入过紧，难以从胶中释放；浓度过低（如 < 0.8%）则凝胶易碎，切胶时易混入杂质，且 DNA 扩散严重。解决方案：根据目的片段大小调整凝胶浓度（100-500bp 用 1.5-2%，500-2000bp 用 1-1.5%，2000-10000bp 用 0.8-1%），确保 DNA 条带清晰且易于释放；

d. 溶胶不彻底导致琼脂糖未完全溶解，DNA 无法充分释放到溶液中。建议严格按试剂盒比例添加溶胶 buffer，50-60℃ 水浴加热溶胶，期间每隔 2-3 分钟颠倒混匀一次，直至胶块完全溶解。

e. 不同试剂盒对特定长度的 DNA 回收率不同，例如 QIAquick Gel Extraction Kit 可以可纯化得到 70 bp 至 10 kb 的 DNA，回收效率高达 95%；MinElute PCR Purification Kit 可以洗脱纯化 70bp-4kb 的 DNA 产物，根据目的片段长度选择合适的试剂。

内容来源：QIAGEN 凯杰