简介
质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因。在研究基因功能时，无论是过表达，还是基因敲除，我们都需要通过 PCR 构建载体，然后转导到大肠杆菌；摇菌扩增后，从细菌中提取质粒，从而用于后续分子或细胞实验。
原理
QIAprep Miniprep 系列为常规分子生物学实验提供了一种快速、简单且经济高效的质粒 DNA miniprep 方法。QIAprep Minipre 系列采用硅胶膜技术，在适当的低盐和 pH 条件下将质粒 DNA 与硅胶膜结合，后续 RNA、蛋白质、染料和低分子量杂质经低盐漂洗缓冲液冲洗而去除，用少量 Tris 缓冲液或无核酸酶水即可洗脱获得高质量的质粒 DNA，纯化的质粒 DNA 可立即使用，不需要苯酚提取和乙醇沉淀。
材料与仪器
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）；
微量离心机、水浴锅或加热模块、冰箱；
5m 、2 ml EP 管、无菌移液枪枪头；
一次性手套、96-100% 乙醇。
步骤
实验开始前准备工作：
1) 将 RNaseA 加入到 Buffer P1 中，混合均匀并储存在 2~8℃ ；
2) 可选：将 LyseBlue 试剂以 1 ：1000 的比例添加到 Buffer P1 中；
3) 将 96-100% 乙醇加入到 PE 缓冲液中（按照说明书比例添加）；
4) 所有离心步骤均微量离心机中以 13,000 rpm（~17,900 x g）的速度进行。
质粒提取：
1) 收集 1-5 ml 的细菌过夜培养物，以 >8000 rpm（6800 x g）离心 3 分钟得到细菌沉淀；
2) 将沉淀的细菌细胞重悬于 250 μl 缓冲液 P1 中，并转移到微量离心管中；
3) 加入 250 μl P2 缓冲液，通过 4-6 次轻柔颠倒混匀，直到溶液变清；
4) 加入 350 μl 缓冲液 N3，通过 4-6 次轻柔颠倒混匀。如果使用 LyseBlue 试剂，溶液将变成无色;
5) 在微量离心机中以 13,000 rpm（~17,900 x g）离心 10 分钟；
6) 通过移液枪将上清液转移到硅胶膜纯化柱中，离心 30-60 秒并丢弃流出液；
7) 加入 0.5 ml PB 缓冲液，离心 30-60 秒并丢弃流出液；
8) 加入 0.75 ml PE 缓冲液，离心 30-60 秒并丢弃流出液；
9) 离心 1 分钟以去除残留的洗涤缓冲液；
10) 将 硅胶膜纯化柱放入干净的 1.5 m 离心管，加入 50 μl EB 缓冲液（10 mM Tris·Cl，pH 8.5）或无酶水到硅胶膜纯化柱的中心，静置 1 分钟，然后离心 1 分钟；
11) 用干净的 1.5 ml 或 2 ml 无菌离心管收集纯化后的质粒 DNA，后续可保存在-20℃ 冰箱内。
注意事项
1. 所有的操作均可在室温条件下进行；
2. 第 3)步骤不要涡旋处理，否则会导致基因组 DNA 污染，且裂解时间不要超过 5 分钟；
3. 第 9）步骤的目的在于去除 PE 缓冲液中残留的乙醇，乙醇未去除干净的话会对下游酶促反应产生抑制影响；
4. 为了提高洗脱效率，可将 EB 缓冲液或无酶水提前在 65℃ 水浴锅或加热模块中预热；
内容来源：QIAGEN 凯杰
来源：丁香实验
