质粒抽提

质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因。在研究基因功能时，无论是过表达，还是基因敲除，我们都需要通过 PCR 构建载体，然后转导到大肠杆菌；摇菌扩增后，从细菌中提取质粒，从而用于后续分子或细胞实验。

QIAprep Miniprep 系列为常规分子生物学实验提供了一种快速、简单且经济高效的质粒 DNA miniprep 方法。QIAprep Minipre 系列采用硅胶膜技术，在适当的低盐和 pH 条件下将质粒 DNA 与硅胶膜结合，后续 RNA、蛋白质、染料和低分子量杂质经低盐漂洗缓冲液冲洗而去除，用少量 Tris 缓冲液或无核酸酶水即可洗脱获得高质量的质粒 DNA，纯化的质粒 DNA 可立即使用，不需要苯酚提取和乙醇沉淀。

实验开始前准备工作：

1) 将 RNaseA 加入到 Buffer P1 中，混合均匀并储存在 2~8℃ ；

2) 可选：将 LyseBlue 试剂以 1 ：1000 的比例添加到 Buffer P1 中；

3) 将 96-100% 乙醇加入到 PE 缓冲液中（按照说明书比例添加）；

4) 所有离心步骤均微量离心机中以 13,000 rpm（~17,900 x g）的速度进行。

质粒提取：

1) 收集 1-5 ml 的细菌过夜培养物，以 >8000 rpm（6800 x g）离心 3 分钟得到细菌沉淀；

2) 将沉淀的细菌细胞重悬于 250 μl 缓冲液 P1 中，并转移到微量离心管中；

3) 加入 250 μl P2 缓冲液，通过 4-6 次轻柔颠倒混匀，直到溶液变清；

4) 加入 350 μl 缓冲液 N3，通过 4-6 次轻柔颠倒混匀。如果使用 LyseBlue 试剂，溶液将变成无色;

5) 在微量离心机中以 13,000 rpm（~17,900 x g）离心 10 分钟；

6) 通过移液枪将上清液转移到硅胶膜纯化柱中，离心 30-60 秒并丢弃流出液；

7) 加入 0.5 ml PB 缓冲液，离心 30-60 秒并丢弃流出液；

8) 加入 0.75 ml PE 缓冲液，离心 30-60 秒并丢弃流出液；

9) 离心 1 分钟以去除残留的洗涤缓冲液；

10) 将 硅胶膜纯化柱放入干净的 1.5 m 离心管，加入 50 μl EB 缓冲液（10 mM Tris·Cl，pH 8.5）或无酶水到硅胶膜纯化柱的中心，静置 1 分钟，然后离心 1 分钟；

11) 用干净的 1.5 ml 或 2 ml 无菌离心管收集纯化后的质粒 DNA，后续可保存在-20℃ 冰箱内。

1. 所有的操作均可在室温条件下进行；

2. 第 3)步骤不要涡旋处理，否则会导致基因组 DNA 污染，且裂解时间不要超过 5 分钟；

3. 第 9）步骤的目的在于去除 PE 缓冲液中残留的乙醇，乙醇未去除干净的话会对下游酶促反应产生抑制影响；

4. 为了提高洗脱效率，可将 EB 缓冲液或无酶水提前在 65℃ 水浴锅或加热模块中预热；

内容来源：QIAGEN 凯杰