• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        胰蛋白酶切蛋白质样品的制备

        相关实验:胰蛋白酶切磷酸化多肽作图实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 用单向或者双向凝胶电泳将 32P 标记的目的蛋白质与其他不需要的成分分开。

        2. 电泳结束后,用 50% 甲醇清洗三次,时间控制在 6 小时,去处 SDS 和电泳缓冲液将凝胶放在两张塞热玢膜(Bio-Rad) 之间吸干。用放射性墨水在凝胶边缘点几个记号。

        3. 置于 X 射线片下曝光,在读片灯下看放射自显影图,找到放射标记的目的蛋白带用干净刀片小心地切下目的胶带,放入带螺帽的离心管用 0.5~1 ml 50 mol/L 碳酸氢铵泡。剥下赛璐玢膜,将胶带修剪成更小的小条。

        4. 加一等份胰蛋白酶(1 μg 溶于 50 mmol/L 碳酸氢铵,TPCK 处理过),于 37℃ 在 360° 旋转器中消化和洗脱几小时或者过夜。

        5. 10000 g 离心样品 5 分钟。小心取出上清,用一小等份做液闪计数估计回收效率。

        6. 用真空离心浓缩器(Savant) 抽干上清。在 50 μl 碳酸氢铵中,用 0.5 μg 胰蛋白酶于 37℃ 继续消化 4 小时。离心抽干样品,用 20 μl pH 1.9 的电泳缓冲液重悬,以去处残余的碳酸氢铵。再次离心抽干样品。此时样品已可进行电泳。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序