双向薄层电泳与层析分离多肽片段

1. 将平板电泳仪（型号 FBE-3000, Phannacia) 放在通过循环仪连接到恒温水浴的冷却板上进行电泳。电泳前 30 分钟将水浴温度调至 10℃ 到 15℃ 之间。每个电极槽加 400 ml 缓冲液。切两张 Whatman 3MM 滤纸（20 cm X 10 cm) 用作电泳缓冲液“灯芯”。

2. 用 5 μl 电泳缓冲液重悬多肽样品（有 500 cpm 或更高的放射活性），加到 20cmx20cm 纤维素薄层板（Merck或Kodak) 的左下角（距每边约 1 英寸）。样品的位置因电泳缓冲液不同而改变。用 pH 1.9 与 pH 3.5 的缓冲液时，样品应点在更靠近阳极的位置；用 pH 8.9 的缓冲液时，则应更靠近阴极。用玻璃毛细管点样，每点一下立即用吹风机吹干，避免样品点变大（直径不要大于 0.5 cm)。加 0.5 μl 指示染料[ 5 mg/ml 二硝基苯基-赖氨酸（黄色）与 1 mg/ml 二甲苯靛蓝 FF ( 蓝色）水溶液的混合物〕到样品点。

3. 薄层层析板放在电泳仪的冷却板上，有纤维素的一面朝上，样品点朝向阳极用打孔器在一张 Whatman 3MM 滤纸（20cmx20cm) 的角上钻一个圆洞（直径 2 cm）：洞的位置应与薄层板上样品点的位置对应。在盘子里用电泳缓冲液将 Whatman 3MM 滤纸浸湿，再用一张干的 Whatman 3MM 滤纸将过量的缓冲液吸去。将滤纸放在薄层板上，比样品点刚好从圆洞处露出来；这样一来，圆洞周边的缓冲液前沿向心移动，带动样品也向点中央浓集。将滤纸整个地压一下，让薄层板充分吸收缓冲液。

4. 将滤纸盖在薄层板两端，两者重叠约 1 cm，这样就将薄层板与电极连通了。在滤纸与薄层板重叠处放两个隔条（直径约 3~4 cm)。薄层板上面再盖上玻璃板，避免缓冲液蒸发。盖上盖子。




5. 1 kV 电泳 1 小时。

6. 电泳结束后，将薄层板置于 65℃ 烤箱 30 分钟烘干。

7. 层析缸放入通风橱，加入缓冲液，放置 1 小时以上，让缸内空气达到饱和。缓冲液深度应低于 0.5 英寸。将薄层板浸入缓冲液，第一向样品带应高于缓冲液表面。

8. 进行层析 3~4 小时。当缓冲液前沿到达层析板顶端时，取出层析板，在通风橱内晾干。用放射性墨水在层析板边缘点 3~4 个记号。