胰蛋白酶切磷酸化多肽作图实验

1. 用单向或者双向凝胶电泳将 32P 标记的目的蛋白质与其他不需要的成分分开。 2. 电泳结束后，用 50% 甲醇清洗三次，时间控制在 6 小时，去处 SDS 和电泳缓冲液将凝胶放在两张塞热玢膜（Bio-Rad) 之间吸干。用放射性墨水在凝胶边缘点几个记号。 3. 置于 X 射线片下曝光，在读片灯下看放射自显影图，找到放射标记的目的蛋白带用干净刀片小心地切下目的胶带，放入带螺帽的离心管用 0

1. 将平板电泳仪（型号 FBE-3000, Phannacia) 放在通过循环仪连接到恒温水浴的冷却板上进行电泳。电泳前 30 分钟将水浴温度调至 10℃ 到 15℃ 之间。每个电极槽加 400 ml 缓冲液。切两张 Whatman 3MM 滤纸（20 cm X 10 cm) 用作电泳缓冲液“灯芯”。 2. 用 5 μl 电泳缓冲液重悬多肽样品（有 500 cpm 或更高的放射活性），加到

1. 加样前。做一次模拟加样，进行整个程序的洗脱，测 OD 初始值。记录所有实验变量：加样量、溶剂梯度、流速、吸收范围等。 2. 制备 32P 标记的胰蛋白酶切样品（需要几千 cpm 才能有效地检测到 32P 标记的多肽 )。用 0.1% TFA 悬浮样品，10000 g 离心 5 分钟使溶液澄清。如果多肽样品难以溶解，可以加入溶于 0.1% TFA 的 5 mol/L 尿素或盐酸胍。离心使溶液