原理
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
材料与仪器
步骤
一、 样品RNA的抽提
1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测
1. 紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
（1）浓度测定
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
（2）纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
（1）制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液
10x MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4 M MOPS，pH 7.0
0.1 M 乙酸钠
0.01 M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品
取3 ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳
上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cDNA合成
1. 反应体系
序号 反应物 剂量
1 逆转录buffer 2 ul
2 上游引物 0.2 ul
3 下游引物 0.2 ul
4 dNTP 0.1 ul
5 逆转录酶MMLV 0.5 ul
6 DEPC水 5 ul
7 RNA模版 2 ul
8 总体积 10 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 ul，37℃水浴60分钟。
3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
1. β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 ul并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
2. 反应体系如下：
标准品反应体系
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 阳性模板上游引物F 0.5 ul
3 阳性模板下游引物R 0.5 ul
4 dNTP 0.5 ul
5 Taq酶 1 ul
6 阳性模板DNA 5 ul
7 ddH2O 32.5 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
3. 管家基因反应体系：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 内参照上游引物F 0.5 ul
3 内参照下游引物R 0.5 ul
4 dNTP 0.5 ul
5 Taq酶 1 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 32.5 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。
3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
2. 反应体系
序号 反应物 剂量
1 10× PCR缓冲液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至总体积为 25 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。
（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、 待测样品的待测基因实时定量PCR
1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
2. 体系配置如下：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq聚合酶 2 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
七、 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
八、电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
注意事项
1.荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。
2.Ct值：在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。
常见问题
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
来源：丁香实验
