Origami(DE3) 感受态细胞100ul*50

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？
答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
产品描述：

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Origami(DE3) 感受态细胞100ul*50	100ul*50	表达感受态细胞

Origami(DE3) 感受态细胞100ul*50注意事项：
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。 
2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。 
3. 转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
PLAC9 Others Human 人 PLAC9 / Placea-specific 9 人细胞裂解液 (阳性对照) 盐酸伊立替康（标准品）Irinotecan HCl Trihydrate质量规格：HPLC>98%,标准品
CM-M061小鼠肾动脉平滑肌细胞完全培养基100mL硝酸异康唑Isoconazole Nitrate质量规格：>99%,BR
EC871214细胞，人食管癌细胞 人脑瘤细胞,SF763细胞 中国仓鼠卵巢细胞;TPO-CHO-I硝酸异康唑(标准品)Isoconazole Nitrate质量规格：HPLC>98%,标准品
Caco-2(人结直肠腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2异维A酸Isotretinoin质量规格：>99.0%,BR
CD5L Others Mouse 小鼠 CD5 aigen-like 人细胞裂解液 (阳性对照) 异维A酸（标准品）Isotretinoin质量规格：HPLC>99%,标准品
GPNMB Others Human 人 GPNMB / HGFIN 人细胞裂解液 (阳性对照) 蓓萨罗丁(标准品)Bexarotene质量规格：>99%
3T3?L1 小鼠脂肪细胞酮洛芬Ketoprofen质量规格：>99%,AR
CL-0246YAC-1(小鼠淋巴瘤细胞)5×106cells/瓶×2酮洛芬(标准品)Ketoprofen质量规格：HPLC>98%,标准品
rCF, 大鼠心脏成纤维细胞富马酸酮替芬Ketotifen fumarate质量规格：>99%,BR
稳定表达EBNA1的人胚肾细胞;293E 人肾皮层上皮细胞完全培养基 100mL富马酸酮替芬(标准品)Ketotifen fumarate质量规格：HPLC>98%,标准品
盐酸镧六水(>99%,BR)  Lanthanum (III) chloride, hexahydrate  质量规格：>99%,BR 动物组织肌质网横小管(TTube)分离试剂盒10
三氧化钼(>98%,BR)  Molybdic oxide  质量规格：>98%,BR 动物组织肌质网三联体(IAD)分离试剂盒10
木瓜蛋白酶悬浮液  Papain 2x crystallized from papaya Latex  质量规格：比活度：>20 U/mg，BC 动物组织基因组DNA分离试剂盒50
苯磺酸钠(>98%，BR)  Sodium benzenesulfonate  质量规格：>98%，BR 动物组织镁ATP酶(Mg++-ATPase)活性比色法定量检测试剂盒20
过氧化物歧化酶(SOD)  Superoxide dismutase from Bovine Erythrocytes(SOD)  质量规格：比活度：>5000 U/mg,BC 动物组织膜性囊泡(RSOV和IOV)制备试剂盒20
三十烷醇(>98%,植物激素级)  Triacontanol  质量规格：>98%,植物激素级 动物组织内质网粗提分离试剂盒10
4-羟基(>98.0%，BR)  4-Hydroxybenzaldehyde  质量规格：>98.0%，BR 动物组织羟脯氨酸(hydroxyproline)比色法定量检测试剂盒20
低内毒素牛血清白蛋白  Albumin, from bovine pH 7.0 Low endotoxin  质量规格：>97%,Biotech Grade 动物组织羟脯氨酸(HYP)比色法定量检测试剂盒20
梭菌蛋白酶  Clostripain  质量规格：酶活：>50U/mg,进分 动物组织氢/ATP酶(H+/K+-ATPase)活性比色法定量检测试剂盒20
2'-脱氧鸟苷-5'-一二钠盐(分子生物学级)  dGMP, 2'-Deoxyguanosine-5'-monophosphate disodium salt  质量规格：>98%，分子生物学级 动物组织氢ATP酶(H+-ATPase)活性比色法定量检测试剂盒20
Origami(DE3) 感受态细胞100ul*50动物组织肌质网粗提分离试剂盒10 二环己基碳二亚胺(>99%,BR)  DCC, Dicyclohexylcarbodiimide  质量规格：>99%,BR
动物组织肌质网横小管(TTube)分离试剂盒10 盐酸镧六水(>99%,BR)  Lanthanum (III) chloride, hexahydrate  质量规格：>99%,BR
动物组织肌质网三联体(IAD)分离试剂盒10 三氧化钼(>98%,BR)  Molybdic oxide  质量规格：>98%,BR
动物组织基因组DNA分离试剂盒50 木瓜蛋白酶悬浮液  Papain 2x crystallized from papaya Latex  质量规格：比活度：>20 U/mg，BC
动物组织镁ATP酶(Mg++-ATPase)活性比色法定量检测试剂盒20 苯磺酸钠(>98%，BR)  Sodium benzenesulfonate  质量规格：>98%，BR
动物组织膜性囊泡(RSOV和IOV)制备试剂盒20 过氧化物歧化酶(SOD)  Superoxide dismutase from Bovine Erythrocytes(SOD)  质量规格：比活度：>5000 U/mg,BC
动物组织内质网粗提分离试剂盒10 三十烷醇(>98%,植物激素级)  Triacontanol  质量规格：>98%,植物激素级
动物组织羟脯氨酸(hydroxyproline)比色法定量检测试剂盒20 4-羟基(>98.0%，BR)  4-Hydroxybenzaldehyde  质量规格：>98.0%，BR
动物组织羟脯氨酸(HYP)比色法定量检测试剂盒20 低内毒素牛血清白蛋白  Albumin, from bovine pH 7.0 Low endotoxin  质量规格：>97%,Biotech Grade
动物组织氢/ATP酶(H+/K+-ATPase)活性比色法定量检测试剂盒20 梭菌蛋白酶  Clostripain  质量规格：酶活：>50U/mg,进分
Origami(DE3) 感受态细胞100ul*50操作方法：
1. DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少15小时。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？
答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。