说明
T4 Polynucleotide Kinase (T4多聚核苷酸激酶,T4 PNK)是一种多聚核苷酸5’-羟基激酶,催化ATP的γ-磷酸基团转移到单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸、3’-单磷酸核苷的5’-OH(正向反应)。该反应是可逆的。当ADP存在时,T4 Polynucleotide Kinase具有5’-磷酸酶活性,催化5’-P-寡聚-/多聚核苷酸和ATP末端5’ -磷酸基团的交换(置换反应)(1)。
该酶也是一种3’-磷酸酶(2)。
来源
大肠杆菌菌株,含有T4噬菌体来源克隆基因pseT。
分子量
该酶是一个二聚体,由两个28.9 �kDa的亚基组成。
活性单位定义
1个活性单位是指37°C、30分钟内将1nmol ATP分子中的γ-磷酸基团转移到5’-OH DNA所需的酶量。
酶活性分析混合物:100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.5 mM 5'-OH DNA, 0.05 mM ATP, 0.1 MBq/ml [gamma-33P]-ATP.
保存缓冲液
保存缓冲液组分:
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 0.1 mM �DTA, 2 mM DTT和50% (v/v)甘油。
10X 反应缓冲液A(正向反应)
500 mM Tris-HCl (pH 7.6, 25°C), 100 mM MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM亚精胺。
10X 反应缓冲液B(置换反应)
500 mM imidazole-HCl (pH 6.4, 25°C), 180 mM MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM亚精胺, 1 mM ADP。
24% PEG溶液
24% (w/v) 聚乙二醇6000。
质量控制
相关测试表明无内切或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染。功能测试为DNA 5’ -末端标记。
抑制与失活
- 抑制剂:金属螯合剂、KCl和NaCl(浓度超过50 �mM时)、磷酸盐、铵离子。
- 失活:75°C加热10分钟或加入EDTA。
备注
- 聚乙二醇(PEG)和亚精胺都会增加磷酸化反应速度和效率(7)。PEG用于置换反应混和物,见操作说明书。
- 铵离子会抑制T4 Polynucleotide Kinase活性,因此磷酸化之前用醋酸钠沉淀DNA (1, 2)。