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- 2026年04月23日
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TUNEL细胞凋亡检测 (TUNEL Apoptosis Assay) 是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现 180-200bp的DNA ladder。
基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。
1.组织切片/细胞爬片；
2.常规TUNEL检测；
3.荧光TUNEL试剂盒检测；
4.数据整理及结果分析。
*根据要求对细胞核进行荧光染色。
二、检测须知：
1.需提供荧光TUNEL检测试剂盒；
2.公司保证数据的客观性、准确性，但不保证与客户预期吻合。
三、实验周期：
15~20天。
四、提供结果：
1.成像图片（或按客户需要排列图片，达到可直接发表水平）；
2.实验详细流程；
3.原始数据；
4.标记后（处理后）的样本。
五、样本要求：
1.悬浮生长培养细胞的甩片或涂片；
2.贴壁生长的培养细胞 ；
3.冰冻切片 ；
4.常规石蜡切片 。
取材保持组织新鲜（组织块以小于2cm×1.5cm×0.3cm为宜），立即放入固定液（固定液用10%福尔马林液或4%多 聚 甲 醛 缓冲液，体积为组织块的10倍以上）中，避免干燥；对于有血迹的样本，可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中；经固定后的样本必须在48小时内处理。
六、注意事项：
1.结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
2.初次检测细胞凋亡，最好设置阳性对照片。血细胞含量高的组织，尽可能延长过氧化氢的灭活时间。苏木素的复染时间需要摸索。
3.每片所加试剂可调整，一般30~100 ul不等，但也要防止液体挥发而干片，且反应均在放置湿盒内。
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文献和实验用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中 TUNEL 法做的最多，我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败，下面我把实验中的关键问题与大家共享一下，同时也希望能对初学者有所帮忙。 TUNEL 法的实验原理 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内，在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合，再用 HRP 标记的链霉
的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。(以TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(增强型，绿色荧光)为例) TUNEL检测：使用20 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟。 二、TUNEL实验中关键步骤 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡前可先将切片在 60ºC烤片 20 min，再使用二甲苯脱蜡2次，每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，便于后期试剂能充分、均匀的结合反应
操作步骤（Roche公司） 1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；3.PBS漂洗2次；4.用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min；5.PBS漂洗2次；6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×
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