Retro|逆向感染/顺行/逆行/跨突触/非跨突触/AAV

在我们的脑中，投射神经元的长距离信息传输对于感知、运动等功能至关重要，因此标记或操作投射神经元是必不可少的研究手段。目前，拥有顺向标记神经元能力的工具比较常见，然而拥有逆向标记能力的工具比较缺乏，且都存在自身局限性。

令人兴奋的是，和元上海依据Neuron杂志近期刊登的重量级文章[1]，成功构建了一种高效率、逆向感染、非跨突触的AAV病毒载体--rAAV2-retro，并在国内首次通过高难度实验（注射脑底BPN脑区，“一针到底”，逆向标记大脑皮层神经元及传递通路）验证了该病毒的功能，为广大科研工作者提供研究利器。

我们为什么需要rAAV2-retro？

目前，拥有逆向标记能力的产品主要分两大类，其一是荧光染料，如Fluoro-Gold，RetroBeads（Lumafluor corp.）；另一类是具有逆向感染能力的病毒。荧光染料虽标记能力强，但只能标记环路，无法像病毒一样结合其他工具（如光遗传）研究环路功能。至于病毒，目前应用的逆向病毒主要有狂犬病毒（RV）、伪狂犬病毒（PRV），但这些病毒神经毒性强，难以应用于研究和临床。因此，我们亟需一种无毒、易操作的高效逆向感染病毒载体，在此背景下，rAAV2-retro应运而生。

rAAV2-retro如何做到逆向感染？效果如何？

和元上海根据2016年10月份Neuron刊登的文章“A Designer AAV Variant Permits Efficient RetrogradeAccess to Projection Neurons”中披露的方法，成功构建了rAAV2-retro。众所周知，普通腺相关病毒（AAV）不具有逆向感染能力，但经过我们对rAAV2-retro衣壳蛋白进行的改造，该病毒能够被轴突末端吸收，并在上级神经元中传递和表达，说明其具有了逆向感染能力，且这种能力是非跨突触的。

为验证效果，Neuron文章作者的重要实验使用rAAV2-retro病毒注射在BPN（基底脑桥核），结果发现BPN上游的脑区（皮质脑桥束和皮层）大量表达了所携带的荧光蛋白（图1，红色）。

图1 BPN注射rAAV2-retro标记皮层-BPN通路

因此，和元上海决定采取与原文同样的、高难度实验，来验证rAAV2-retro的逆向感染效果，该实验总结起来便是“一针到底”。我们在脑底BPN脑区注射病毒，经过两至三周的表达后检测皮层和皮质脑桥束的表达情况（图2）。在实测结果中，我们能够清晰地看到和元上海构建的rAAV2-retro-SYN-EGFP病毒成功逆向感染了BPN-皮层通路（图2绿色荧光）。除此之外，更多的验证实验结果即将出炉，和元上海将第一时间与大家分享。

图2 BPN注射和元上海构建rAAV2-retro能够高效地逆向标记皮层-BPN通路

除被证明拥有逆向感染能力，rAAV2-retro的逆向效率还非常高（见图3），远高于其他病毒，甚至高于荧光金染料，充分说明该工具的强大。

图3 rAAV2-retro的高效逆向感染能力

rAAV2-retro是一个全能选手

除了能逆向标记广泛的神经通路，如皮层/丘脑/杏仁核至纹状体的投射通路，丘脑/海马/内嗅皮层至前额叶的投射通路等，rAAV2-retro还展现了优秀的携带基因工具的能力。原文作者成功验证了rAAV2-retro与Cre-LoxP系统、钙离子成像技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术的结合（图4-5）。

图4 rAAV2-retro应用于钙离子成像技术

图5 rAAV2-retro应用于CRISPR/Cas9基因编辑技术

rAAV2-retro的未来应用

rAAV2-retro为广大的普通实验室提供了安全的、高效的逆向感染病毒，通过多种顺行/逆行、跨突触/非跨突触病毒的配合使用，研究者将能够多维度解析复杂的神经网络连接。同时，由于rAAV2-retro具备携带基因工具（如光遗传工具、钙敏感染料、基因编辑工具、RNA干扰工具等）的能力，其将在神经环路功能的研究中大放异彩。
此外，在基因治疗中，rAAV2-retro也将占据一席之地。在中枢神经系统疾病中，大量注射药物可能会误伤那些正常脑区的神经元，而rAAV2-retro携带治疗作用的药物蛋白或基因定点注射到疾病关键脑区，实现药物的特异性逆向递送，即达到“少量用药，广泛作用，治疗疾病”的美好愿景。

总之，rAAV2-retro是一种拥有高效逆向感染能力，且能够与多种前沿技术结合的新型腺相关病毒载体。

面对如此强大的工具，睿智的您还在等什么？赶紧联系和元上海订购吧！

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参考文献：
[1] Tervo DG, Hwang BY, Viswanathan S, Gaj T,Lavzin M, Ritola KD, et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient RetrogradeAccess to Projection Neurons. Neuron. 2016;92(2):372-82.