电击法细胞融合试剂盒

电击法细胞融合试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

电击法细胞融合试剂是一种旨在促进实验动物细胞合二为一的电击融合性介质和权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用的细胞种类包括小鼠和大鼠细胞株、人体细胞株、胚胎细胞株、肿瘤细胞株、悬浮细胞株、植物细胞株等。应用于融合杂交瘤细胞产生抗体，肿瘤细胞和人体树突状细胞融合产生免疫细胞，以及人鼠细胞融合产生染色体单体等。产品严格无菌，即到即用，融合效率高。

技术背景

电极法细胞融合（electro-cell fusion）为三步过程：首先细胞进入交流电场（alternating electrical field）后，细胞形成串珠成直线；第二步，电流转为直流电场（direct electrical field），使细胞膜的介质击穿（dielectrical breakdown），形成细孔（pore），并与邻近细胞产生小细胞通道（channels），最终导致细胞融合；最后，直流电场去除后，细胞孔关闭，完整杂合体细胞（hybrid）产生。该方法被证实是一种有效的代替病毒（Sendai）和化学试剂的融合方法，已成功用于植物细胞、动物细胞以及生殖细胞的融合。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升
融合液（Reagent B） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞培养
筛选培养液：用于筛选杂合体细胞
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
台式离心机：用于样品操作
48孔培养板：用于融合细胞筛选和培养的容器
BTX Enhancer 400：用于电击细胞

实验步骤

在实施细胞融合前，要选择好两个带有筛选标记的父代细胞株，例如一个带有HPRT缺陷型（GMS10004试剂盒）且抗生素抗性的，另一个反之。存活的细胞杂合子具有HPRT和抗生素抗性。当开始下列操作之前，先将清理液（Reagent A）、融合液（Reagent B）、用户自备的完全细胞培养液放进37℃恒温水槽预热。然后开始下列操作。

1. 在融合操作前24小时，将两个75cm²细胞培养瓶里的父代细胞用胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液脱离传代一次（注意：此步骤非常重要）
2. 次日，分别抽掉两个待融合的父代细胞培养瓶里（75cm²细胞培养瓶）的培养液
3. 分别加入xx毫升 清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面
4. 分别抽掉5毫升清洗液
5. 分别加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液，铺满整个培养平面
6. 置入37℃培养箱3分种
7. 用手震动培养瓶，使细胞脱落，然后分别加入xx毫升清理液（Reagent A）
8. 充分混匀后，在血细胞计数器上进行细胞计数
9. 分别加入3 x 10⁶的两个父代细胞合并到一个15毫升锥形离心管（注意：如果其中一个为类淋巴母细胞（linphoblastoid），则需要12 x 10⁶细胞总量）
10. 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
11. 小心抽去上清液
12. 加入xx毫升清理液（Reagent A），充分混匀
13. 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
14. 小心抽去上清液，用手指轻轻弹击直至细胞颗粒群松散
15. 重复实验步骤12至14二次
16. 加入xx毫升融合液（Reagent B），充分混匀
17. 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
18. 小心抽去上清液，用手指轻轻弹击直至细胞颗粒群松散
19. 重复实验步骤16至18一次
20. 加入xx微升融合液（Reagent B）
21. 轻柔枪头上下抽吸2至3次混匀细胞
22. 转移到2毫米电击杯
23. 插入到电击槽，实施电击（建议使用BTX Enhancer 400：

30AC Volts，22 秒，5 post fusion AC seconds
300DC volts， 15毫秒，3 pulses
0（zero）重复

24. 移取电击杯里的细胞到50毫升锥形离心管
25. 加入50毫升用户自备的DMEM完全培养基，混匀细胞
26. 分别移取500微升到2个48孔板里的每一个孔里
27. 放进37℃细胞培养箱孵育24小时
28. 小心抽去培养孔里的培养液
29. 分别加入500微升用户自备的筛选培养液（例如HAT/G418筛选培养液等）
30. 开始细胞筛选，直至获得融合杂合子细胞克隆（20至28天）

注意事项

1. 本产品为10次操作
2. 所有冻存融合操作和使用工具均须在严格无菌状态下进行
3. 融合操作前，务必使待融合细胞进行胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液脱离传代一次
4. 本公司提供 DMEM完全细胞培养液（YD12052）
5. 细胞筛选，通常14天后，出现存活的细胞克隆；采用96孔板可以获得无数单一克隆
6. 本公司提供系列细胞技术试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定无病毒和支原体污染
3. 本产品经鉴定能使植物细胞、动物细胞、人体细胞、人鼠细胞等融合成功率高达95％

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。