HSV1单克隆抗体的制备及应用

互联网2011-05-24

5830

R&D of Monoclonal Antibodies for HSV1

一、HSV1简介

HSV，又称为单纯疱疹病毒 (herpes simplex virus)是一种双链DNA病毒。主要有两个血清型：HSV-1和HSV-2。

HSV1是引起病毒性角膜炎、病毒性脑膜炎、口唇、生殖器黏膜和新生儿感染的主要病原体。其感染在全世界非常普遍，不仅可产生原发性感染，而且还能产生潜伏感染和复发性感染。近年来HSV1感染具有明显上升的趋势。

HSV的检测方法包括：

传统培养法：“金标准”，时间长，标准方法需2~14天，改良法也需要16-48小时，实验室条件要求较高。

分子生物学检测：包括核酸杂交技术和PCR。更敏感，并可同时对HSV进行分型，但实验要求较高，有假阳性问题。

免疫学检测：以抗HSV单克隆抗体为基础，包括抗原检测和血清学检查，具体方法有免疫荧光试验、免疫印迹试验、ELISA等。

由于抗体分子具有特异识别抗原的功能，抗体技术一直是生物技术的热点领域。免疫学检测的技术关键之一是制备特异性强，亲和力大，滴度高的特异性抗体。

二、单克隆抗体制备流程

（一）动物的选择与免疫

多采用6-12周龄SPF级雌性Balb/c小鼠。

免疫方法取决于所用抗原的性质。

免疫流程同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

（二）细胞融合

· 细胞融合关键：

· 细胞比例为1:10-1:5

· 融合过程操作要轻柔

· PEG厂家、批次、作用时间、温度控制

· 缓慢终止细胞融合

· 培养用优质胎牛血清

融合后细胞培养：注意细胞培养无污染

（三）阳性克隆筛选

筛选方法以灵敏度高、特异性好、简便快捷为标准选择，还要考虑到抗原的具体性质。

（四）杂交瘤的克隆化

（五）杂交瘤细胞的冻存和复苏

（六）单克隆抗体的大量生产

· 体外培养法收获细胞上清

· 小鼠体内接种杂交瘤细胞收获腹水

三、单克隆抗体的鉴定

· 杂交瘤细胞核型分析

· 分泌抗体稳定性

· 单抗特异性鉴定

· 单抗Ig亚类的鉴定

· 识别抗原表位鉴定

· 单抗亲和力的鉴定

四、单克隆抗体的纯化、标记

五、杂交瘤细胞制备结果

融合得到的细胞岛：

杂交瘤细胞株的获得：

经细胞融合，阳性克隆筛选及杂交瘤细胞株的克隆化培养，获得19株分泌抗HSV1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经特异性交叉反应实验获得1C6、1D8、4A7、5A2和5D8 五株HSV1特异性抗体。

六、单克隆抗体制备结果

单抗特异性鉴定：

杂交瘤细胞核型分析：

经Gimsa染色，显微镜下观察，杂交瘤细胞的染色体数目均在96-105条之间，为小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞染色体之和。

单抗识别抗原表位的鉴定：

单克隆抗体纯化结果：

SDS-PAGE检测其纯度：

HRPO标记单克隆抗体1C6结果：

过Sephacryl S-200柱，标记物洗脱曲线：

将峰值各管收集，测其OD280和OD405，可得标记抗体C=2.09mg/ml HRPO[M]/Ab[M]=2.5

单抗HRPO标记是否成功？

直观验证：

七、HSV1单克隆抗体的应用

血清中IgM抗体的测定：

血清中IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。

间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。

血清中针对某抗原的IgM和IgG同时存在，大量存在的IgG会干扰IgM抗体的测定。

间接ELISA测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白处理或抗IgG抗体中和，以除去IgG的干扰。

捕获法ELISA：

在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获ELISA。

抗体捕获法为ELISA方法中的一种，用固相包被抗IgM (μ链)抗体和抗原特异性“捕获”待测的IgM抗体。

避免了间接ELISA在方法学上的缺陷，消除了特异性IgG和类风湿因子(RF)对实验结果的干扰。

捕获法特异性更强、灵敏度更高。

捕获法ELISA试剂盒：

经大量实验摸索，优化各个实验条件，我们研制了高质量的检测血清中HSV1 IgM抗体的捕获法ELISA试剂盒。

捕获法对选材要求更高：试剂中的抗原、酶联物等试剂具有特异性。需要用不同的抗原和酶联物来检测相应的抗体，不可相互“通用” 。因此试剂生产成本较高。

其他应用：

· ELISA：采用双抗夹心ELISA检测HSV1。

· 免疫胶体金：利用免疫层析原理制备免疫胶体金试纸条来检测HSV1。

· 免疫荧光：采用自制荧光标记HSV1 McAb以直接免疫荧光法(DFA)检测HSV1，以期可获得一种用于临床应用的快速检测HSV抗原的方法。

八、四正柏生物简介

北京四正柏生物科技有限公司（Beijing 4A Biotech Co., Ltd）致力于生物技术产品的研发和生产，以为生命科学工作者提供全方位高水准的产品及技术服务为经营宗旨，有别于众多国内企业单纯代理贸易的简单运营模式，更加强调高端技术的掌握和优化、自有产品的研发和生产，强调良好的售后服务和技术支持，努力打造中国乃至全球知名品牌。

公司聘用多名国内外专家建立多种技术平台，专业技术人员学历均在硕士以上，产品涉及分子生物学、细胞生物学、免疫学等领域，除国内销售网络外，在北美、欧洲等地业已建立相应销售渠道。

四正柏公司目前重点产品集中在以下几个方面：单/多克隆抗体制备、纯化与标记；试剂盒开发与应用；细胞因子与流式抗体系列产品。公司自主开发的产品通过国际标准的质控方可投放市场，质量达到或超越国内外优秀公司同类产品水平。随着公司业务的不断发展和客户认同度的不断提高，我们的产品范围会进一步拓宽并延伸至生物学研究的各个领域。

"成为生物学研究领域全面产品的供应商、最新技术的推广者和生命科学工作者可信赖的朋友"，这是四正柏始终如一的追求目标！

产品研发：

· 抗体制备、纯化及标记

· 免疫学检测技术

· 流式细胞术

主要产品及服务：

· 流式细胞分析试剂：

· 流式检测抗体

· 流式检测试剂盒

· 流式检测辅助试剂

细胞因子试剂盒：

· 人细胞因子ELISA检测试剂盒