WB一抗、二抗稀释液-100ml

【原创】暗室实验（化学发光底物检测方法）及Western Blot实验优化方法

暗室实验 暗室实验的操作流程： 1. 新鲜配制1-2ml工作液（A液与B液1:1或1:40混合配制） 2. 进入暗室，在黑暗的条件下，加入1μl未稀释的二抗（HRP连接物） 3. 混合后，可立即在暗室中观察到蓝色光 暗室实验的注意事项： ? 工作液按正确比例混合，且新鲜配制 ? 在暗室中加入二抗 ? 直接使用未稀释的二抗 ? 加入二抗后，立即观察 注：暗室实验可同时检测底物是否有活性，以及二抗是否有活性。 如果暗室实验结果阴性： 更换其它二抗，再次进行

操作篇：western blot 之封闭及杂交

台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。 3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min，进行化学

western-blot实验方法

中。将预冻的冷却装置放入槽内。 缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。 （10）盖好盖子，接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。 （11）转膜结束后，断开电源，拆卸转膜夹子，逐一掀去各层。将膜用1 × 丽春红染色5 min，用水冲洗3 次，观察蛋白转印是否完全。同时也可将凝胶用考马斯亮蓝染色，胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。 （12）免疫反应： I 封闭：用镊子将膜移至含有25 mL 封闭液的平皿中，用脱色摇床室温缓慢摇匀