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Fpg

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    ♦ 单细胞凝胶电泳（彗星试验）（4，5，6）
    ♦ 碱性析出（7）
    ♦ 碱解旋（8）
    ♦ 修饰的切刻平移技术（9）


    概述
    Fpg（甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA 糖基化酶）也称作 8-氧代鸟嘌呤 DNA 糖基化酶，既有 N-端糖基化酶活性也有 AP-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下双链 DNA 上受损的嘌呤碱基，产生一个脱嘌呤（AP）位点。AP-裂解酶活性可以切割 AP 位点的 3'或 5' 端，因此可以除去 AP 位点，产生一个具有 3' 和5' 磷酸的碱基缺口。
    被 Fpg 识别并切除的受损碱基包括：7，8-二羟基 8-氧代鸟嘌呤（8-氧代鸟嘌呤）、8-氧代腺嘌呤、fapy-鸟嘌呤、甲基-fapy-鸟嘌呤、fapy-腺嘌呤、黄曲霉毒素 B1-fapy-鸟嘌呤，5-羟基-胞嘧啶和 5-羟基尿嘧啶（1，2）。


    来源
    克隆有 fpg 基因的重组 E. coli 菌株（3） 。


    反应条件
    1X NEBuffer 1 + BSA [10 mM Bis Tris 丙烷-HCl，10 mM MgCl2 ，1 mM DTT( pH7.0 @25°C)]。加入100 μg/ml BSA。37°C温育。


    质保声明
    无核酸内切酶和外切酶污染。


    单位定义
    1 单位指在 10 μl 反应体系中，37 ℃ 条件下，1 小时能够切割 1 pmol 含单个与胞嘧啶配对的8-氧代鸟嘌呤的 34 bp 寡核苷酸双链所需要的酶量。


    活性检测条件
    在 10 μl 反应体系中 1X NEBuffer 1 中加入 10 pmol 荧光标记的寡核苷酸双链和 100 μg/ml BSA。


    彗星试验的推荐稀释倍数
    1:103 ～1:104   (4，5，6，10) 。详细步骤见www.neb-china.com 。


    浓度
    8,000 units/ml。


    贮存条件
    50mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.5 mM EDTA， 200 μg/ml BSA 和 50% 甘油。于 -20°C 贮存。


    热失活
    60°C 10分钟。


    参考文献
    (1) Tchou, J. et al. (1994) J. Biol. Chem ., 269, 1518–1524.
    (2) Hatahet, Z. et al. (1994) J. Biol Chem ., 269, 18814–18820.
    (3) Boiteux, S. et al. (1987) EMBO J ., 5, 3177–3183.
    (4) Singh, N. et al. (1988) Experimental Cell Research ,175, 184–191.
    (5) Collins, A. et al. (1993) Carcinogenesis , 14, 1733–1735.
    (6) Collins, A. et al. (1996) Environmental HealthPerspectives , 104, 465–469.
    (7) Pflaum, M. et al. (1998) Free Rad. Res ., 29, 585–594.
    (8) Hartwig, A. et al. (1996) Toxicology Letters , 88, 85–90.
    (9) Czene, S. and Harms-Ringdahl, M. (1995) MutationResearch , 336, 235–242.
    (10) Guthrie, E., New England Biolabs, Inc., unpublishedobservations.


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