Cre 重组酶

pLox2+ (已线性化)
#N0417S   10 μg    ¥ 639.00

♦ 两个 loxP 位点之间 DNA 的切割

♦ 含 loxP 位点 DNA 分子的融合

♦  loxP 位点之间 DNA 序列的翻转

Cre 重组酶是细菌噬菌体 P1 的 I 型拓扑异构酶，催化 loxP 位点间的DNA进行位点特异性重组(1)。本酶无需能量辅助因子，Cre 介导的重组很快在底物与反应产物之间达到平衡(2)。loxP 识别元件是一个 34bp 序列，其两端是两个 13bp 的反向重复序列，中间是起定向作用的 8 bp 间隔区(3)。重组产物根据 loxP 位点的位置和相对方向而不同，两个含单 loxP 位点的 DNA 将被融合。两个正向重复 loxP 位点间的 DNA 将以环状形式切割，而两个反向 loxP 位点间的 DNA 序列将被翻转。

纯化自重组 E.coli 菌株，其中携带有编码细菌噬菌体 P1 的 Cre 重组酶的质粒，酶的 N 端添加了丙氨酸和甘氨酸残基(4)。

1X Cre 重组酶反应缓冲液
[33 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂ ]，37°C温育。

1 单位指在 50 μl 反应体系，37°C 条件下，30 分钟使 0.25 μg 的 pLox2+ 对照 DNA 产生最大位点特异性重组所需要的酶量。最大重组可以通过琼脂糖凝胶电泳分析或通过反应物转化后行氨苄抗性平板筛选。

1,000 units/ml。

250 mM NaCl, 15 mM Tris-HCl (pH 8.0 @ 25°C) 和 50% 甘油。于 -20°C 贮存。

70°C 10分钟。

建议进行琼脂糖凝胶电泳前，将 Cre 重组酶反应混合物于 70°C 温育 10 分钟。

由于 Cre 重组酶反应是一个动态平衡过程，用 loxP 2+ 对照底物仅有 20-30% 发生重组(图1)。由于重组产物的量较少，故溴化乙锭染色后呈现微弱条带，同时伴有底物染色强度相应减弱。

延长温育时间不会提高重组效率，相反，还可能导致大分子量重组产物的生成。

反应中增加 Cre 重组酶量将形成loxP依赖性 Cre - DNA 复合物，从而抑制重组反应。

线性化 pLox2+长3.65 kb, 距两端 350 bp 远处各有一 loxP 位点。两 loxP 位点之间有一复制原点和一个氨苄青霉素抗性基因。loxP 位点之间的重组产生一个环状的氨苄青霉素抗性质粒 (0.8% 琼脂糖凝胶电泳约 1.7 kb 大小) 和一个 850 bp长的 DNA 片段。

(1) Abremski, K. and R. Hoess (1984) J. Biol. Chem ., 259, 1509–1514.
(2) Abremski, K. et al. (1983) Cell , 32, 1301–1311.
(3) Metzger, D. and Feil, R. (1999) Curr. Opin. Biotechnol ., 10, 470–476.
(4) Cantor, E. and Chong, S. (2001) Protein Expression and Purification , 22, 135–140.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1 ：Cre/loxP位点特异性重组