T4 DNA 连接酶

■ 粘性末端和平齐末端均可连接

■ 限制性酶切片段的克隆（3）

■ 将 linker 或 adapter 连接到 DNA 片段的平齐末端

■ 室温或 16 ℃ 均有活性

该酶催化契合的双链DNA或RNA的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口(1) 。

纯化自 E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8(2) 。

1X T4 DNA 连接酶缓冲液 [50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25 ℃），10 mM MgCl₂ ，10 mM DTT，1 mM ATP]。推荐 DNA 5' 末端浓度为 0.1－1.0 μM。

无核酸内切酶和外切酶污染。每批T4 DNA 连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出连接后 DNA 末端的任何损伤。结果表明超过 99.9% 的 DNA 末端保持完好。

1 单位指在 20 μl 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16 ℃ 反应条件下，30 分钟能使 50% 的经 HindIII 消化的 λDNA 片段 [5' 端浓度为 0.12 μM （300 μg/ml）]连接所需的酶量。

400,000 units/ml 和 2,000,000 units/ml。

50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μg/ml BSA 和 50% 甘油,-20°C 贮存。

65°C 10分钟。

为方便起见，连接反应可以在室温（20-25 ℃）条件下进行。粘性末端连接：在 20 μl反应体系中加入 1 μl T4 DNA 连接酶，反应 10 分钟。平齐末端连接：在 20 μl 反应体系中加入 1 μl T4 DNA连接酶反应 2 小时，或者加入 1 μl 高浓度 T4 DNA 连接酶反应 10 分钟。

另外，NEB 快速连接试剂盒 [NEB #M2200S（30 次反应），或 NEB #M2200L（150 次反应）] 可在室温下 5 分钟内完成平齐和粘性末端的连接。

与大肠杆菌 DNA 连接酶需要 NAD⁺ 作辅因子不同，T4 DNA 连接酶的辅因子是 ATP。

稀释后的 T4 DNA 连接酶应保存于 -20 ℃，50% 甘油贮存缓冲液（稀释缓冲液 A，NEB #B8001）。如稀释后马上使用，则可用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。

只要在反应体系中补加 1 mM ATP，连接反应就可以在 NEB 提供的四种限制性内切酶缓冲液（NEBuffers）或在 T4 DNA 多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。

(1) Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). In P.D. Boyer (Ed.), The Enzymes , Vol. 5, (p. 3). San Diego: Academic Press.
(2) Remaut, E., Tsao, H. and Fiers, W., (1983) Gene , 22,103–113.
(3) Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual , (2nd ed.), (pp.1.53–1.73). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.