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Taq DNA 连接酶

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    ♦  耐热性好
    ♦  可在 PCR 和连接酶链式反应过程中掺入磷酸化寡核苷酸
    ♦  可用连接酶检测反应和连接酶链式反应对等位基因进行特异性检测（1，3）
    ♦  可通过 PCR 扩增掺入磷酸化寡核苷酸进行诱变（4）


    概述
    Taq DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成，使杂交到同一互补靶DNA链上的两条契合寡核苷酸链的5´-磷酸末端和3´-羟基末端通过磷酸二酯键连接。这个连接反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对并且二者之间没有空隙的条件下才可发生。因此，可以用它来检测单碱基替换。在45°C-65°C范围内，Taq DNA连接酶均有活性(1,2) 。


    来源
    重组E. coli 菌株，含有从Thermus aquaticus HB8中克隆的连接酶基因(1) 。


    反应条件
    1X Taq DNA 连接酶反应缓冲液 [20 mM Tris-HCl（pH 7.6 @ 25 ℃），25 mM KAc，10 mM Mg(Ac)2 ，10 mM DTT，1 mM NAD 和 0.1% Triton X-100]，45 ℃ 温育。
    本酶需 NAD+ 作辅因子，NAD+ 已被添加在 10X Taq DNA 连接酶缓冲液中；为了延长 NAD+ 的半衰期，缓冲液应于 -70℃ 贮存。


    质保声明
    无单链 DNA 内切酶、外切酶、核酸酶或磷酸酶活性污染。


    单位定义
    （粘性末端活性单位）
    1 单位是指在 50 μl 反应体系中，45 ℃ 反应条件下，15 分钟能使 50% 的 12 bp 粘性末端片段发生连接所需要的酶量。12 bp 粘性末端来自于 BstEII 消化 1 μg λDNA。


    活性检测条件
    在 50 μl 反应体系中，加入 1X Taq DNA 连接酶缓冲液和 1 μg 经 BstEII 消化的 λDNA。45 ℃ 温育 15 分钟, 加入终止染液（50% 甘油，50mM EDTA 和溴酚兰）终止反应。然后 70 ℃ 加热 10分钟，在 0.7% 的琼脂糖凝胶上电泳。由于反应体系中存在连接酶，即使 70 ℃ 加热处理后，经 BstEII 消化的 λDNA 粘性末端仍会保持连接状态。


    浓度
    40,000 units/ml。


    贮存条件
    贮存条件： 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1.0 mM DTT, 200 μg/ml BSA 和 50% 甘油。-20°C 贮存。


    热失活
    无。


    参考文献
    (1) Barany, F. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 88, 189–193.
    (2) Takahashi, M. et al. (1984) J. Biol. Chem ., 259, 10041– 10047.
    (3) Barany, F. (1991). The Ligase Chain Reaction in a PCR World , (pp. 5–16). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
    (4) Michael, S.F. (1994) Biotechniques , 16, 411–412.


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