• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        【交流】关于NEB的T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒的常见问题及解答

        丁香园论坛

        9145
        因为看到园子中使用NEB T4 DNA连接酶的老师和同学比较多,也经常就一些连接的问题进行讨论和沟通。今天发一个关于NEB T4 DNA连接酶的一个专题,就使用过程中一些常见问题跟大家讨论一下。也希望各位老师同学能够踊跃参与,如果大家有什么疑问或者好的建议欢迎。

        一、关于NEB M0202 T4 DNA 连接酶的使用方法和常见问题及解答

        1、产品特性和使用方法

        产品说明:该酶催化契合的双链DNA或RNA的5'-磷酸末端和3'-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接,还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口(1)。



        --------------------------------------------------------------------------------

        来源: 源于E.coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 (2)。

        应用:

        限制性酶切片段的克隆 (3)。
        将linker或adapters 连接到DNA片段的平滑末端。
        反应缓冲液: 1X T4 DNA Ligase Buffer:
        [50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 µg/ml BSA, (pH 7.5 @ 25°C)]。推荐DNA浓度(0.1 - 1 µM 的5′末端)。

        使用注意:ATP是反应必须的辅因子。这一点与要求NAD作辅因子的大肠杆菌DNA连接酶不同。

        如在反应体系中补加1 mM的ATP,连接反应还可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液(NEBuffers)或在T4 DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。

        质量保证: 无核酸内、外切酶污染。每批T4 DNA连接酶均通过模拟克隆实验进行检测,该实验可以检测出待连接DNA末端的任何破坏。结果表明>99.9%的DNA末端未受任何降解。

        单位定义(粘性末端活性单位):在20µl连接反应体系、0.12µM (300µg/ml)的5'-末端浓度条件下,16°C反应30分钟,能使50% 的经Hind Ⅲ消化的λDNA片段连接所需的酶量定义为一个NEB单位。

        一个粘端连接活性单位=0.015个韦氏(ATP-PP交换)单位(4)。

        一个韦氏单位=67个粘端连接活性单位。

        浓度:400,000 units/ml和2,000,000 units/ml。

        贮存条件: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%的甘油,-20°C贮存。

        热失活条件: 65°C 加热10分钟。

        室温连接反应:为方便起见,连接反应可以在室温(20-25°C)条件下进行。粘性末端连接:在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA连接酶,反应10分钟。平滑末端连接:在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA 连接酶反应2小时,或者加入1µl高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。

        另外,NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V [15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。

        图1:在25°C条件下,用1 unit(1:400稀释后取1 µl)T4 DNA连接酶连接λDNA/Hind Ⅲ片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图2:在20 µl反?µ逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。
        【交流】关于NEB的T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒的常见问题及解答
        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序