CAR-T定制开发（人源和鼠源）

小鼠CAR-T肿瘤杀伤模型构建全流程：从病毒包装到体外杀伤评价

正文

【摘要】 CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法是当前肿瘤免疫治疗的前沿方向。在小鼠模型中评价CAR-T的抗肿瘤活性，对理解基因型调控、免疫微环境交互等机制具有重要意义。本文系统介绍了一种基于逆转录病毒载体的小鼠CAR-T构建方案，涵盖CAR结构设计、病毒包装与纯化、T细胞分选激活、CAR-T制备及体外杀伤活性评价全流程，可为相关研究者提供操作参考。

【关键词】 CAR-T；逆转录病毒；T细胞分选；肿瘤杀伤模型；MC38；免疫治疗

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1. 背景与模型选择

CAR-T疗法通过基因工程改造T细胞，使其表达特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体。目前CAR-T在血液系统肿瘤（如B-ALL、LBCL、多发性骨髓瘤）中已取得突破性疗效，靶点主要为CD19和BCMA。在实体瘤领域，靶点探索包括EGFR、GPC3、CLDN18.2、MSLN等。

模型选择考量：

• NSG鼠/裸鼠模型：适用于评价人源CAR-T的异体移植（CDX/PDX）抗肿瘤活性

• 小鼠CAR-T模型：适用于评价小鼠不同基因型（如代谢调控）对CAR-T的影响，或其他免疫细胞对CAR-T的调控作用

由于小鼠T细胞几乎不表达LDLR受体，慢病毒感染效率极低，因此小鼠CAR-T常用逆转录病毒载体（MSCV或MMLV）进行基因递送。

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2. CAR结构设计

目前CAR已发展至四代。由于第三代和第四代CAR在小鼠T细胞中极易丢失，小鼠CAR常以第二代为主。

第二代CAR结构组成：

结构域	常用元件	功能
Signal peptide	CD8信号肽	引导CAR表达至细胞膜
抗原识别域	scFv（如抗CD19）	特异性识别肿瘤抗原
Hinge	CD8铰链区	提供空间柔性
Transmembrane	CD8跨膜区	锚定细胞膜
共刺激域	CD28	增强T细胞活化和增殖
信号域	CD3ζ	T细胞活化核心信号

载体选择： MSCV（鼠干细胞病毒）逆转录病毒载体或MMLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录病毒载体。

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3. 逆转录病毒包装与纯化

3.1 病毒包装体系

体系	细胞	质粒	转染试剂
体系1	293T / Phoenix ECO	PCL-ECO + PMSCV（或MMLV）	PEI
体系2	Plat-E	PMSCV（或MMLV）	PEI

3.2 病毒包装操作（以体系2为例）

1. 细胞复苏：取冻存Plat-E细胞37°C快速溶解，离心后DMEM完全培养基重悬，T25培养瓶培养，传代2次后使用

1. 细胞铺板：取生长良好的Plat-E细胞，胰酶消化后按1×10⁶个/皿接种至10cm培养皿，8字混匀法混匀，培养箱培养24-48h

1. 质粒转染（PMSCV-eGFP-mCD19）：
   • 待细胞密度至70%-80%，弃上清，换新鲜无抗生素DMEM完全培养基
   • 取1mL DMEM基础培养基（或OPTI-MEM），加入10μg PMSCV-eGFP质粒和30μL PEI转染试剂，吹打均匀，室温放置10-15min
   • 将混合液均匀滴加至10cm培养皿中
   • 6-8h后更换新鲜DMEM完全培养基
   • 48h后荧光显微镜观察转染效率

1. 病毒收取：分别收取48h和72h病毒上清（约20mL），4°C保存

3.3 病毒纯化（超速离心法）

1. 将48h和72h病毒上清4°C 2000g离心5min，去除细胞沉淀

1. 收集上清，0.45μm滤器过滤，去除细胞碎片

1. 将48h和72h病毒混匀，加入超速离心管（无菌），配平至误差<0.01g

1. 超速离心：26000rpm（约80000g），4°C，2.5h

1. 离心结束后可见白色病毒沉淀贴附管壁，缓慢吸弃上清（注意勿触碰沉淀）

1. 加入0.5mL预冷PBS重悬，4°C放置30min

1. 完全溶解后0.22μm滤器过滤除菌（可选）

1. 以50-100μL/管分装，-80°C保存

注： 病毒纯化方法可根据需求选择超速离心法、超滤管浓缩法或浓缩试剂盒法。

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4. 小鼠T细胞分选与激活培养

4.1 小鼠脾脏淋巴细胞获取与T细胞分选

1. 小鼠断颈处死，无菌取出脾脏，置于70μm细胞筛网中研磨

1. 用细胞分选缓冲液（EasyIso™ Buffer，货号EISO0500）冲洗获得单细胞悬液

1. 按照目标T细胞类型选择分选试剂盒：
   • CD3 T细胞：货号SN4101
   • CD4 T细胞：货号SN4102
   • CD8 T细胞：货号SN4103

1. 按试剂盒说明书操作完成磁珠分选

关键提示： 分选缓冲液质量直接影响后续T细胞激活和病毒感染效率。劣质缓冲液可能导致T细胞无法有效激活，最终影响CAR-T制备成功率。

4.2 T细胞激活与培养

1. 推荐使用T淋巴细胞专用培养基（货号C400100），也可自行配置：
   • 1640基础培养基 + 10% FBS + 1% P/S + 1% L-Glutamine + 50μM β-巯基乙醇 + 1% 非必需氨基酸 + 1% HEPES

1. 将分选的T细胞（2×10⁶/mL）与CD3/CD28激活磁珠（货号AM2001）按1:1混匀

1. 接种至24孔板（未TC处理，non-treated），1mL/孔

1. 24-48h后观察T细胞聚团、膨大，确认激活成功

1. 若继续培养，隔天按1:3传代

注： 24孔板必须使用non-treated板，以避免T细胞过度贴壁影响激活效果。

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5. CAR-T细胞构建（病毒转染）

转染时间线

时间	操作
Day 0	24孔non-treated板加入1mL 20μg/mL Retronectin，封口膜封闭，4°C过夜
Day 1（步骤1）	吸弃Retronectin上清，2% BSA室温封闭2h，PBS润洗1次
Day 1（步骤2）	纯化逆转录病毒用PBS稀释，按5/10/20/50 MOI加入孔板，2000-4000g 4°C水平离心2-3h
Day 1（步骤3）	吸弃上清（病毒已包被于孔板），每孔加入8×10⁵ T细胞，封口膜封闭，300g离心5min，入培养箱
Day 3	48h后观察绿色荧光表达，按1:3传代
Day 4	72h流式细胞术测定阳性率

CAR阳性率检测方法

病毒类型	检测方法
含eGFP/mCherry荧光标记	直接流式检测荧光信号
不含荧光标记	Protein L-FITC或anti-4GS linker-FITC标记30min后流式检测

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6. 肿瘤细胞稳转株构建（MC38-mCD19-luc）

6.1 慢病毒包装

1. 取生长良好的293T细胞铺板（10cm皿）

1. 待密度至70%-80%进行转染

1. 质粒配比：Plvx-mCD19-puro / Plvx-luciferase-G418 : PSPAX2 : PMD2.G = 4:3:1（共16μg）+ 48μL PEI

1. 混匀后室温放置10-15min，滴加至培养皿

1. 6-8h换液，收取48h和72h病毒上清

1. 超速离心法纯化（同逆转录病毒纯化流程）

6.2 MC38-mCD19稳转株构建

1. MC38细胞胰酶消化，按1×10⁵/孔接种6孔板

1. 待密度至30%-50%，加入Lentivirus-mCD19-puro（10 MOI）+ 10ng/mL polybrene + 2mL DMEM培养基

1. 24h后换液

1. 72h后加入含5μg/mL puromycin的DMEM培养基筛选

1. 筛选培养7-14天获得稳转株

1. 流式检测CD19表达，必要时挑取单克隆

6.3 MC38-mCD19-luciferase稳转株构建

1. 取MC38-mCD19细胞，胰酶消化后1×10⁵/孔接种6孔板

1. 待密度至30%-50%，加入Lentivirus-luciferase-G418（10 MOI）+ 10ng/mL polybrene + 2mL DMEM

1. 24h后换液

1. 72h后加入含800μg/mL G418的DMEM培养基筛选

1. 筛选培养14天获得稳转株

1. 如需单克隆：96孔板梯度稀释至单细胞/孔，扩大培养后WB和流式鉴定

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7. CAR-T体外杀伤活性评价

实验流程

1. 取生长良好的MC38-mCD19-luciferase细胞，24孔板铺板，1×10⁵/孔

1. 待细胞贴壁后吸弃上清

1. 按效靶比1:1、2:1、4:1、8:1加入小鼠CAR-T-mCD19细胞（即1×10⁵、2×10⁵、4×10⁵、8×10⁵/孔）

1. 共孵育48h

检测方法

方法一：上清荧光素酶活性测定

• 48h后吸取上清，加入荧光素酶底物

• 测定培养基中luciferase值

• 原理： MC38细胞被杀伤后释放luciferase至培养基，上清活性越高代表杀伤越强

方法二：细胞剩余荧光素酶活性测定

• 细胞PBS润洗2次

• 加入500μL 1mg/mL荧光素酶底物（若buffer不可裂解细胞，需先用ATP裂解液裂解20min）

• 上机读取数据

• 原理： 数值越低说明剩余MC38细胞越少，杀伤越强

方法三（备选）： 收集细胞流式分选，观察肿瘤细胞与T细胞比例变化。此方法精度有限，因肿瘤细胞和T细胞均会增殖。

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8. 试剂来源

本方案中涉及的细胞分选试剂盒、T细胞激活磁珠、培养基等试剂由英诺思生物科技（Eynos LifeScience）提供。英诺思生物聚焦免疫细胞分选、培养和基因调控，产品线覆盖人/小鼠T细胞及亚型（CD3/CD4/CD8）、B细胞、NK细胞等分选试剂盒，同时提供CAR-T逆转录病毒包装、靶细胞构建等技术支持服务。

本方案相关试剂清单：

货号	试剂名称	用途
EISO0500	EasyIso™ Buffer（细胞分选缓冲液）	脾脏细胞悬液制备、分选缓冲体系
SN4101	Mouse CD3 T Cell Isolation Kit	CD3 T细胞分选
SN4102	Mouse CD4 T Cell Isolation Kit	CD4 T细胞分选
SN4103	Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	CD8 T细胞分选
AM2001	ActBeads™ Mouse T细胞激活磁珠	CD3/CD28双信号激活
C400100	小鼠T淋巴细胞培养基	T细胞培养

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9. 实验注意事项小结

1. 缓冲液质量：分选缓冲液直接影响T细胞后续激活和感染效率，不可忽视

1. 培养板选择：T细胞激活和病毒转染步骤均需使用non-treated板

1. 病毒保存：纯化后病毒需分装保存，避免反复冻融，-80°C长期保存

1. TGF-β等细胞因子：稳定性差，溶解后需小体积分装冻存，每次实验取一管

1. 效靶比设置：建议设置梯度（1:1至8:1），以获得完整的杀伤曲线

1. 荧光素酶检测：注意区分上清检测（杀伤释放）和细胞检测（剩余存活），两者解读方向相反