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慢病毒包装/慢病毒载体/Lentivirus
TU/ml
1.1 慢病毒介绍
慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂（图1）。
慢病毒载体具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗，CRISPR/Cas9文库构建使用的也是慢病毒载体。
1.2 慢病毒载体优势
1）表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，细胞实验必选，常用于构建稳转株。
2）安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。
3）免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。
| 病毒特性 | 病毒类型 | |||
| 慢病毒(LV) | 腺相关病毒(AAV) | 腺病毒(ADV) | 逆转录病毒(RV) | |
| 包膜 | 有 | 无 | 有 | 有 |
| 颗粒直径 | 90-100 nm | 20-30 nm | 60-90 nm | ~100nm |
| 基因组 | dsRNA | ssRNA | dsDNA | dsDNA |
| 插入目的片段大小 | 4kb左右 | 2.8kb左右 | 6kb左右 | 1kb左右 |
| 外源基因表达时间 | 2-4天开始表达，长时间稳定表达 | 7-14天开始表达 | 1-2天开始表达，作用时间2周左右 | 2-3天开始表达 |
| 体内扩散能力 | 一般 | 强 | 强 | 一般 |
| 免疫原性 | 中等 | 极低 | 强 | 中等 |
| 滴度范围 | 108~109TU/ML | 1012~1013VG/ML | 1010~1011PFU/ML | 107~108TU/ML |
| 滴度检测方法 | qPCR整合DNA | qPCR非整合DNA | 抗原抗体免疫染色试剂盒 | qPCR整合DNA |
| 整合方式 | 随机高频整合 | 定向低频整合 | 非整合 | 随机高频整合 |
| 应用范围 | 体外细胞感染，gRNA文库筛选， 体内 | 基于不同的血清型，体内广泛应用 | 嗜肝，快速表达或短期表达，血液、心脏，细胞系等 | 特异性只感染分裂期的细胞 |
1.3 常规应用
体外感染细胞
慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。
慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。
慢病毒体外感染细胞的效果图
慢病毒与腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒载体相比，具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点。慢病毒包装主要用于难转染细胞的感染，稳转株的制备，神经系统的定位注射实验。难转染的细胞主要包括干细胞、免疫细胞（如DC细胞）、肿瘤细胞等，此外，慢病毒还可以感染仓鼠胚胎制备转基因动物。
慢病毒感染细胞时，由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI值在不同实验室也略有差异，下面我们提供公司部分细胞的慢病毒MOI感染参数，供实验参考（以下数据是细胞感染效率在80%细胞状态良好的情况下获得的）：
| 细胞名 | 中文名称 | 慢病毒感染MOI |
| MGC80-3 | 人胃癌细胞 | 10 |
| HT-29 | 人结肠癌细胞 | 20 |
| RKO | 人结肠腺癌细胞 | 10 |
| Caki-1 | 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞 | 10 |
| 5637 | 人膀胱癌细胞 | 10 |
| U-118 MG | 人脑星形胶质母细胞瘤 | 10 |
| RWPE-1 | 人正常前列腺上皮细胞 | 20 |
| HeLa | 人宫颈癌细胞 | 10~20 |
| Ca Ski | 人宫颈癌肠转移细胞 | 10 |
| MCF7 [MCF-7] | 人乳腺癌细胞 | 10 |
| A549 | 人非小细胞肺癌细胞 | 10(中科院为40-80） |
| NCI-H1299 | 人非小细胞肺癌细胞 | 20 |
| U-87 MG | 人脑星形胶质母细胞瘤 | 10 |
| U251 | 人胶质瘤细胞 | 10 |
| A172 | 人胶质母细胞瘤细胞 | 10 |
| K-562 | 人慢性髓原白血病细胞 | 10 |
| HL-60 | 人原髓细胞白血病细胞 | 10 |
| GES-1 | 人胃上皮细胞 | 20 |
| U266 | 人骨髓瘤细胞 | 20 |
| CAL 27 | 人舌鳞癌细胞 | 20 |
| PC9 | 人肺癌细胞 | 5 |
| PC14 | 人肺癌细胞 | 10 |
| MADB-106 | 大鼠乳腺癌细胞 | 20 |
| F98 | 大鼠脑胶质瘤细胞 | 20 |
| MHCC-97H | 人肝癌细胞（高转移） | 10~20 |
1.4 案例介绍（和元客户文章）
1.4.1 慢病毒在肿瘤研究中的应用
常通过构建稳转株，体外进行细胞功能学实验，进一步构建肿瘤模型，验证基因功能。
【1】Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]
慢病毒干扰： Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1
【2】Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
慢病毒过表达/干扰：pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro
1.4.2 慢病毒在神经系统的应用（在体注射）
1．Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆]
病毒类型：慢病毒
载体名称：LV-Suv39h1-RNAi（不确定详细的）
注射部位：海马DG区
病毒注射量：2 μL，9.98 × 108 TU/mL
检测时间：2周
2．Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路]
病毒类型：慢病毒
载体名称：LV- CX36-shRNA-EGFP（不确定详细的）
注射部位：P1小鼠新皮层L1
病毒注射量：1μL
检测时间：2周
3．Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症]
病毒类型：慢病毒
载体名称：Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位：小鼠海马CA1区
病毒注射量：1μL
检测时间：4周
1.5 慢病毒延伸服务
和元上海慢病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒或四质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下我们的慢病毒的滴度在108~109TU/ml，完全可以满足各类实验的使用要求。
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姜女士
上海市浦东新区国际医学园区紫萍路908弄19号楼
试剂,细胞库 / 细胞培养,技术服务
生产厂商
2019.12.09-2020.01.31
2019.11.12-2020.01.31
2018.03.02-2020.12.31
