临床样本转录组和蛋白表达分析
鉴定IUA患者与正常子宫内膜之间的差异表达基因和相关信号通路。
对正常和IUA患者子宫内膜进行RNA-seq，并通过免疫组化、免疫荧光和Western blot检测DKK1、自噬标志物、纤维化标志物和巨噬细胞标志物。
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DKK1缺失通过自噬和外泌体介导的巨噬细胞向肌成纤维细胞转化促进子宫内膜纤维化
DKK1 loss promotes endometrial fibrosis via autophagy and exosome-mediated macrophage-to-myofibroblast transition.
实验完整度
高包含临床样本、体外细胞实验和条件性基因敲除小鼠模型，并进行了功能验证和机制研究，证据层级丰富。
主要模型
人子宫内膜基质细胞系（T-HESCs）和原代子宫内膜基质细胞（PHESC） DKK1条件性敲除小鼠（Dkk1fl/fl，PR-Cre+/-） IUA患者子宫内膜组织和正常子宫内膜组织
重点核对
DKK1在IUA患者子宫内膜中表达下调 DKK1 KO抑制自噬通量，表现为LC3-II、ATG7降低，P62升高 DKK1 KO通过Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR通路调节自噬 DKK1 KO促进外泌体分泌和IL-8表达 雷帕霉素（3 mg/kg/day，腹腔注射，2周）部分逆转DKK1 CKO小鼠的纤维化表型
摘要
背景：宫腔粘连（IUA）表现为子宫内膜纤维化，常导致不孕或复发性流产；然而，其发病机制尚不清楚。目的：本研究利用临床样本以及体外和体内实验，评估Dickkopf WNT信号通路抑制剂1（DKK1）和自噬在子宫内膜纤维化中的作用。方法：采用免疫组织化学、免疫荧光和蛋白质印迹法检测DKK1在子宫内膜中的定位和表达；采用DKK1沉默和DKK1过表达检测DKK1沉默或表达在子宫内膜细胞中的生物学效应；采用DKK1基因敲除小鼠观察DKK1基因敲除引起的表型。结果：在IUA患者中，DKK1和自噬标志物下调；此外，子宫内膜中α-SMA和巨噬细胞定位增加。DKK1条件性敲除（CKO）小鼠表现出纤维化表型，子宫内膜中自噬减少，α-SMA和巨噬细胞定位增加。体外研究表明，DKK1敲除（KO）抑制了子宫内膜基质细胞的自噬通量。相反，DKK1的异位表达表现出相反的表型。机制上，我们发现DKK1通过Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR通路调节自噬通量。进一步研究表明，DKK1 KO促进了外泌体中白介素（IL）-8的分泌，从而促进巨噬细胞增殖和转移。此外，在DKK1 CKO小鼠中，用自噬激活剂雷帕霉素治疗部分恢复了子宫内膜纤维化表型。结论：我们的研究结果表明，DKK1是IUA潜在的诊断标志物或治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DKK1在子宫内膜纤维化（IUA）中的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- DKK1缺失通过Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR通路抑制自噬，导致外泌体分泌增加和外泌体中IL-8水平升高，进而促进巨噬细胞增殖、迁移和向肌成纤维细胞转化（MMT），最终导致子宫内膜纤维化。
- 主要证据
- 临床样本显示IUA患者子宫内膜中DKK1和自噬标志物下调、α-SMA和巨噬细胞增多；DKK1 CKO小鼠呈现纤维化表型；体外实验证实DKK1 KO抑制自噬通量、促进外泌体分泌和IL-8上调，且IL-8可促进巨噬细胞增殖和转化；雷帕霉素治疗部分逆转纤维化表型。
- 研究意义
- DKK1可能是IUA潜在的诊断标志物或治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠模型表型分析
在体内验证DKK1缺失对子宫内膜纤维化的影响。
生成DKK1条件性敲除小鼠（Dkk1fl/fl，PR-Cre+/-），通过Masson染色、免疫组化、免疫荧光和Western blot检测纤维化程度、自噬标志物和巨噬细胞浸润。
细胞自噬功能验证
验证DKK1对子宫内膜基质细胞自噬的调控作用。
在人子宫内膜基质细胞系和原代细胞中敲低或过表达DKK1，通过Western blot检测自噬相关蛋白表达。
机制通路验证
阐明DKK1调控自噬的分子机制。
通过RNA-seq分析DKK1 KO细胞的转录组，并通过Western blot检测Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达。
外泌体分泌验证
验证DKK1 KO对外泌体分泌的影响及其机制。
提取DKK1 KO和WT细胞的外泌体，通过Western blot、电子显微镜和ELISA检测外泌体标志物和数量。
巨噬细胞功能实验
验证DKK1 KO外泌体对巨噬细胞增殖、迁移和转化的影响。
用DKK1 KO和WT细胞的外泌体处理巨噬细胞，通过EdU、Transwell和Western blot检测增殖、迁移和纤维化标志物。
体内药物干预验证
验证自噬激活剂能否逆转DKK1 CKO小鼠的纤维化表型。
对DKK1 CKO小鼠腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg/day）或DMSO对照，2周后通过Masson染色、免疫组化和免疫荧光检测纤维化程度和自噬标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取和测序 | RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74134 |
| RNA质量检测 | RNA Nano 6000分析试剂盒 | Agilent | 5067-1511 |
| 免疫组化 | HRP标记的二抗 | Typng | 17901353-1 |
| DAB底物 | Typng | TPB13 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Abcam | 104139 |
| 细胞培养 | 无酚红DMEM/F12培养基 | Sigma | -- |
| 活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 胰岛素转铁蛋白硒 | Gibco | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞鉴定 | PowerPlex 16 HS系统 | Promega | -- |
| 支原体检测 | LookOut支原体PCR检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MP0035 |
| JumpStart Taq DNA聚合酶 | Sigma-Aldrich | D9307 | |
| 基因敲低 | siRNA寡核苷酸 | Genepharma | -- |
| 基因过表达 | DKK1慢病毒表达载体 | GeneCopoeia | LPP-U0513-DKK1 |
| 外泌体分离 | 贝克曼库尔特Optima L-100 XP超速离心机 | Beckman Coulter | -- |
| 外泌体表征 | NanoSight LM10系统 | NanoSight | -- |
| NTA 2.1软件 | Nanosight | -- | |
| 细胞增殖 | Cell-Light Apollo567体外试剂盒 | RiboBio | -- |
| Western blot | ImageJ软件 | NIH | -- |
| IHC定量 | Image-Pro Plus软件 | Media Cybernetics | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件8.0版 | GraphPad Software | -- |
| Western blot | 抗DKK1抗体 | Proteintech | 21112-1-AP |
| 抗WNT5A/B抗体 | Proteintech | 55184-1-AP | |
| 抗Dvl3抗体 | Proteintech | 13444-1-AP | |
| 抗β-连环蛋白抗体 | Proteintech | 51067-2-AP | |
| 抗磷酸化GSK-3β抗体 | Proteintech | 67558-1-Ig | |
| 抗I型胶原抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | |
| 抗III型胶原抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| 抗IV型胶原抗体 | Proteintech | 17023-1-AP | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Proteintech | 15613-1-AP | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| 抗ATG5抗体 | Proteintech | 10181-2-AP | |
| 抗ATG7抗体 | Proteintech | 67341-1-Ig | |
| 抗Beclin1抗体 | Proteintech | 11306-1-AP | |
| 抗P62抗体 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| 抗LC3抗体 | Proteintech | 14600-1-AP | |
| 抗ATF4抗体 | Proteintech | 10835-1-AP | |
| 抗TFEB抗体 | Proteintech | 13372-1-AP | |
| 抗磷酸化RPS6KB抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗RPS6KB抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 抗EIF4E抗体 | Cell Signaling Technology | 2067 | |
| 抗磷酸化EIF4E抗体 | Cell Signaling Technology | 9741 | |
| 抗MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗磷酸化MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 山羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗TSG101抗体 | Abcam | ab30871 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 免疫组化 | 抗LAMP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9091 |
| 动物模型 | PgriresCre/+小鼠 | Cyagen Biosciences | 017915 |
| Dkk1flox/flox小鼠 | Cyagen Biosciences | -- | |
| 细胞系 | 人永生化子宫内膜基质细胞系 | ATCC | CRL-4003 |
| 人原代子宫内膜基质细胞 | Procell Life Science&Technology Co., Ltd. | CP-H233 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 正常对照组为输卵管性不孕患者，IUA组经宫腔镜确诊；采样前2个月未服用雌激素或孕激素 阅读提示：Materials and methods: Endometrial tissues of normal and IUA patients |
| RNA-seq分析 | 样本量：3例正常和3例IUA患者子宫内膜；差异表达基因筛选标准：|fold change|≥2，P<0.05 阅读提示：Materials and methods: Next-generation sequencing technology; Results: DKK1 decreased in endometria of IUA patients |
| 细胞培养 | T-HESCs (CRL-4003)和PHESC (CP-H233)；培养基：DMEM/F12无酚红，添加10%活性炭/葡聚糖处理的FBS、1% ITS、1.5 g/L碳酸氢钠、500 ng/mL嘌呤霉素；37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and methods: Endometrial stromal cells |
| siRNA转染 | DKK1 siRNA序列：DKK-1-1和DKK-1-2；转染后72小时进行Western blot检测 阅读提示：Materials and methods: Plasmids and siRNA transfection |
| 外泌体提取 | 超速离心参数：320g 10min，2000g 15min，100,000g 70min（两次）；使用无外泌体FBS 阅读提示：Materials and methods: Exosome purification |
| 动物实验 | 小鼠品系：C57BL/6J背景，Dkk1fl/fl,PR-Cre+/-；每组5只；光照/黑暗循环12小时，相对湿度50±1%，温度22±1°C 阅读提示：Materials and methods: Mice |
| 雷帕霉素处理 | 腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg/day）或等体积DMSO，持续2周 阅读提示：Figure legend 7A |