TRIM65在肾纤维化模型中的表达分析
检测TRIM65在肾纤维化组织和细胞中的表达水平。
通过IHC和Western blot检测UUO和叶酸模型小鼠肾脏以及TGF-β1处理的HK-2细胞中TRIM65的表达。
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TRIM65缺失通过NUDT21介导的选择性多聚腺苷酸化减轻肾纤维化
TRIM65 deficiency alleviates renal fibrosis through NUDT21-mediated alternative polyadenylation.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HK-2、HEK293T、ACHN）和两种动物模型（UUO、FAN），并进行功能验证（敲低/过表达、AAV9介导的体内敲低）和机制验证（酵母双杂交、Co-IP、GST pull-down、泛素化、蛋白稳定性、APA分析）。
主要模型
UUO小鼠肾纤维化模型 叶酸诱导肾病（FAN）小鼠模型 HK-2人肾小管上皮细胞 HEK293T细胞
重点核对
TRIM65敲除小鼠（Trim65-/-）的构建与验证 UUO手术的具体操作（6/0丝线结扎左侧输尿管） 叶酸诱导肾病模型的剂量（250 mg/kg，腹腔注射） TGF-β1诱导纤维化模型的浓度（10 ng/mL）和处理时间（24小时、48小时） AAV9-si-NUDT21肾盂注射的剂量（2×10^11 v.g./小鼠）和预处理时间（3周）
摘要
慢性肾脏病（CKD）是全球主要的健康问题，也是过早死亡的第三大原因。肾纤维化是驱动CKD进展的主要过程，但其背后的机制尚未完全明了，导致治疗选择有限。在此，我们发现E3连接酶TRIM65是肾纤维化的正调控因子。在由单侧输尿管梗阻（UUO）和叶酸诱导的小鼠肾纤维化模型中，TRIM65的缺失导致病理损伤和肾纤维化的减少。通过酵母双杂交系统筛选，我们鉴定了TRIM65的一个新相互作用蛋白，哺乳动物切割因子I亚基CFIm25（NUDT21），它通过选择性多聚腺苷酸化（APA）在纤维化中发挥关键作用。TRIM65与NUDT21相互作用，诱导其第56位赖氨酸的K48连接的多聚泛素化及蛋白酶体降解，从而抑制TGF-β1介导的SMAD和ERK1/2信号通路。NUDT21的降解随后改变了一些促纤维化基因（包括Col1a1、Fn-1、Tgfbr1、Wnt5a和Fzd2）的3'UTR长度和序列内容（3'UTR-APA）。此外，通过流体力学肾盂注射腺相关病毒9（AAV9）降低NUDT21表达，加重了正常小鼠肾脏中UUO诱导的肾纤维化，并阻断了TRIM65缺失的保护作用。这些发现表明，TRIM65通过调节NUDT21介导的APA促进肾纤维化，并强调TRIM65是减少CKD患者肾纤维化的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM65在肾纤维化中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- TRIM65与NUDT21直接相互作用，促进NUDT21 K56位点的K48连接多聚泛素化和蛋白酶体降解，导致促纤维化基因（如Col1a1、Fn-1、Tgfbr1、Wnt5a、Fzd2）3'UTR缩短，并激活TGF-β1介导的SMAD和ERK1/2信号通路，从而促进肾纤维化。
- 主要证据
- TRIM65在UUO和叶酸诱导的肾纤维化小鼠模型及TGF-β1处理的HK-2细胞中表达上调；TRIM65缺失减轻了UUO和叶酸诱导的肾纤维化，并抑制了SMAD2/3和ERK1/2的磷酸化；TRIM65与NUDT21相互作用并促进其泛素化降解；AAV9介导的NUDT21敲低阻断了TRIM65缺失的保护作用。
- 研究意义
- 首次建立了TRIM65、NUDT21和肾纤维化之间的联系，表明TRIM65是治疗纤维化疾病的一个有前景的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TRIM65缺失对肾纤维化的影响
验证TRIM65缺失是否减轻肾纤维化。
对Trim65-/-和WT小鼠实施UUO手术或叶酸注射，通过组织学染色、IHC、Western blot和RT-qPCR评估肾损伤和纤维化程度。
TRIM65在体外对TGF-β1诱导纤维化的调控
探究TRIM65对肾小管上皮细胞纤维化反应的影响。
在HK-2细胞中敲低或过表达TRIM65，用TGF-β1刺激，检测促纤维化蛋白表达和信号通路激活。
TRIM65与NUDT21的相互作用验证
验证TRIM65与NUDT21之间的物理相互作用。
采用酵母双杂交、Co-IP、GST pull-down和免疫荧光共定位实验检测TRIM65与NUDT21的结合。
TRIM65介导NUDT21的泛素化修饰
验证TRIM65是否促进NUDT21的泛素化及其连锁类型和位点。
在HEK293T细胞中共转染TRIM65、NUDT21和泛素突变体，通过IP-Western blot分析泛素化形式和位点。
TRIM65对NUDT21蛋白稳定性及APA的调控
探究TRIM65是否通过降解NUDT21影响APA。
通过CHX追踪实验检测NUDT21半衰期，并利用RT-qPCR检测促纤维化基因dPAS使用率。
体内验证NUDT21在TRIM65调控肾纤维化中的关键作用
验证NUDT21是否介导TRIM65在肾纤维化中的作用。
通过肾盂注射AAV9-si-NUDT21敲低肾脏NUDT21，在WT和Trim65-/-小鼠中诱导UUO模型，检测纤维化指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 叶酸 | Servicebio | -- |
| 细胞培养与处理 | 重组人TGF-β1蛋白 | Sino Biological | -- |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A+G | Beyotime | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Takara | T9108 |
| 两步法cDNA合成试剂盒 | YEASEN | 11141ES60 | |
| SYBR Green PCR预混液 | YEASEN | 11201ES08 | |
| Western blot | ECL化学发光底物试剂盒 | YEASEN | 36208ES60 |
| ChemiDoc XRS+系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞免疫荧光 | 含DAPI抗淬灭封片剂 | Solarbio | S2110 |
| TRIM65抗体 | Atlas Antibodies | HPA021578 | |
| 细胞免疫荧光/免疫共沉淀 | NUDT21抗体（小鼠） | Proteintech | 66335-1-Ig |
| Western blot | α-SMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP |
| 纤维连接蛋白抗体 | CST | 26836 | |
| Kim-1抗体 | Abcam | ab233720 | |
| 波形蛋白抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 6004-1-Ig | |
| 微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| Smad2/3抗体 | CST | 8685 | |
| pSmad2/3抗体 | CST | 8828 | |
| ERK1/2抗体 | CST | 68303 | |
| pERK1/2抗体 | CST | 45899 | |
| JNK抗体 | CST | 9252 | |
| pJNK抗体 | CST | 4668 | |
| P38抗体 | CST | 9212 | |
| pP38抗体 | CST | 4511 | |
| P65抗体 | CST | 8243 | |
| pP65抗体 | CST | 3033 | |
| IKKβ抗体 | Proteintech | 40906 | |
| pIKKβ抗体 | CST | 2697 | |
| Nudt21抗体（兔） | Proteintech | 10322-1-AP | |
| Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| GFP抗体 | Proteintech | 50430-2-AP | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 泛素抗体 | CST | 3936 | |
| K48抗体 | CST | 8081 | |
| K63抗体 | CST | 5621 | |
| GST抗体 | CST | 2625 | |
| LaminB抗体 | Wanleibio | WL01775 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | Procell | -- | |
| 动物实验 | AAV9-si-NUDT21 | OBiO Technology | -- |
| AAV9-si-Control | OBiO Technology | -- | |
| 组织染色 | H&E染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| Masson染色试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 天狼星红染色试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 蛋白提取 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| 蛋白磷酸酶抑制剂 | Solarbio | P0100 | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 鼠龄、体重、性别、麻醉和手术细节、给药剂量和途径、术后天数 阅读提示：Materials and methods中的Animals、UUO model、Folic acid-induced nephropathy model |
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源、培养条件、血清饥饿时间、TGF-β1浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods中的Cell culture and treatment |
| 分子相互作用验证 | 转染质粒、抗体、IP条件、MG132浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods中的Ubiquitination assay、Reagents and antibodies、Figure 5和Figure 6图注 |
| APA分析 | RNA提取方法、引物序列、dPAS引物设计、定量方法 阅读提示：Materials and methods中的RT-qPCR、Table 2、Figure 7图注 |
| 体内基因敲低实验 | AAV9-si-NUDT21的构建、注射剂量和途径、UUO手术时间点 阅读提示：Materials and methods中的Adeno associated virus (AAV) injection、Results中的TRIM65 targets NUDT21 to regulate renal fibrosis |