实验问答

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问Annexin V 法测细胞凋亡时的阴性对照是什么意思？

赵栋2012

matianzhong战友回答：Annexin V测凋亡一般与PI联合用，Annexin V与早期凋亡细胞膜结合来检测，PI只能进入死细胞和晚期凋亡。制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：1. 没有染色的细胞。2. 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞。3. 仅用PI染色的细胞。

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问为什么抗原修复结果里假阳性很多？

tao0129

1.抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来。2.免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果。3.而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合，故不需抗原修复。4.第一次TUNEL反应只需37度反应1h，或者延长时间即可。

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问苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?

赵栋2012

返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45℃温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50 ml 自来水＋三四滴的氢氧化铵。

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问TUNEL 法的实验原理是什么？

tao0129

基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视

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问细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？

tao0129

1.蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；2.蛋白酶K一般工作液浓度为20 ug/ml ，但浓缩液可配制1~10 mg/ml ，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；3. 蛋白酶K反应时间一般为10~30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 um 左右的片子可以用10

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问TUNEL 实验中几个关键步骤是什么？

tao0129

1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20 min，再用二甲苯两次5~10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30 min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1 h

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问求问红细胞凋亡实验原理和步骤？

我是金博士

这里有一篇比较老的文献，供你参考，另外万方和维普中有很多相关研究的。http://www.biomart.cn/experiment/430/488/498/33578.htm

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问微波修复时是否该阻断？

赵栋2012

1. 微波修复的目的是什么？在免疫组化中是用来抗原修复，暴露抗原决定族，利于抗原抗体反应；而罗氏细胞凋亡试剂盒说明书中应该也没有提及抗原修复吧？2. TUNEL检测细胞凋亡原理是用来测定DNA断裂的3‘-OH和TDT-dUTP结合，他们的结合反应不是抗原抗体反应原理，该方法的关键是如何使TDT-dUTP等试剂充分进入细胞核内进行反应，所以应该有细胞通透这一步骤，用蛋白酶K、Triton等均可。3.

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问实验中怎样染色才会达到最佳程度？

赵栋2012

初次做凋亡，一般按照试剂盒说明书做即可，但要附上阳性对照。根据结果进行对实验过程调整。我个人认为试验过程中tunel酶反应的时间、过氧化氢的灭活时间、DAB染色时间、苏木素复染时间、PBS浸洗时间等都可以通过上次试验结果进行微调从而使试验染色达到最佳。

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问荧光显像后用什么封片？

赵栋2012

一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封固（必要性不大）。

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问mirna206RT-PCR 引物和内参有什么资料可参考学习？

我是金博士

请你明确问题，是miRNA RT-PCR还是miRNA real time PCR?

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问肝细胞膜蛋白的免疫组化需要注意点什么呀？

gynju

免疫组化关键还是抗原的修复和一抗是否好用，曾经做出来过应该是没有问题的。DAB显色是需要在显微镜下观察的，有的时候非常快的，几十秒都可能出来，建议可以每次多做一张片子，把它放在显微镜下调好焦距然后再滴加DAB，同时记录时间，然后按时间做其它的片子。

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问蛋白诱导表达量低，并且检测不出活性是怎么回事？

我是金博士

这个问题很常见，能表达出蛋白不容易，表达出的蛋白有活性也不容易。不过不用太着急，可以试着从这几个方面着手： 1、首先要确定是否有目的蛋白条带，是否落在理论大小处。这个可以通过SDS-PAGE来观察。2、如果表达量低，建议优化表达条件，比如改变温度，诱导剂浓度等。然后将蛋白纯化后再测酶活。3、没有活性还有一个可能是你的活性检测方法不对，这个需要你结合实验室基础或者文献来修缮，没有固定的方法。

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问DNA 纯化为何只说硅胶膜吸附法？

我是金博士

方法一是硅胶膜吸附法，方法二是离子交换住法，而磁珠吸附法已经不怎么用了。方法一适合去除一些杂带等，方法二则能纯化得比较彻底。你可能只看到方法1，没看到方法2哦。一般都建议方法2的。

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问是否罗氏的试剂盒并不需要后面的脱水、透明步骤？

tao0129

罗氏凋亡试剂盒有两种方案。1 一种荧光显微镜观察和一种DAB显色。因为他用的是荧光素标记的dUTP，若用荧光显微镜观察，那后面的酶标记抗荧光素抗体就不要孵育了，也不要脱蜡透明，只要用抗荧光催灭封片液封片即可。2 而后者还是需要进行POD-抗荧光素抗体孵育，最后还要进行脱蜡、透明和中性树胶封片。

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问肿瘤细胞诱导血管生成模型，有相关中外文文献么？

1474 围观

问膜片钳是一个监测技术的概念，还是一个监测器械的概念？

774 围观

问细胞免疫荧光步骤需要注意的问题？

我是金博士

具体步骤是：1、细胞爬片2、4%多聚甲醛固定10 min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)3、PBS漂洗5 min4、0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)5、PBS漂洗2次，每次5 min6、1%BSA封闭30 min7、加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2 h8、PBS漂洗2次，每次5 min9、加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1 h10、PBS漂

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问在做PCR的引物设计时添加酶切位点应该考虑哪些问题？

我是金博士

1、移码：这是最重要的，一定要放到具体的质粒上去看，看看你加的酶切位点，连上你的目的基因，是不是会引起移码。2、酶切位点是否好切：尽量选实验室常用的，前提是你的基因片段不能有酶切位点序列，要不然就会连基因也切碎了。3、保护碱基：针对不同的酶切位点，选择不同的碱基。一般是3个，至于具体选CG还是AT就要看你的引物Tm以及碱基含量。

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问苏木素复染后还用盐酸酒精分化吗？

tao0129

1.盐酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是减弱过强的苏木素核染色。所以你若把握好苏木素着色，也可不分化。2.分化时间不能过长，否则阳性着色也褪色。

1 回答2935 围观

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