实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问请问有关于等温滴定量热的相关内容吗？

dxywode

等温滴定量热（isothermal titration calorimetry，ITC）与荧光偏振类似，也是一种研究生物分子间相互作用的先进技术手段。ITC检测方式与化学反应中的酸碱滴定法相似，在ITC测定中，首先将一种反应物置于一个温控样品池中，并通过一个热电偶回路与一个参比池相偶联，样品池和参比池处于相同的外部环境。特定的滴定剂（按实验需要选择）定量滴加到样品池中，当样品与滴定剂发生反应时，样

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问流式细胞术巨噬细胞分析

txs900416

一般巨噬细胞流式需要封闭，封闭得好的话是只有一群的，固有层巨噬细胞应该是f4/80阳性，建议楼主封闭完全+染cd11b，可看到双阳的就是巨噬细胞。如果出现中表达和高表达，建议在确定没有非特异性染色的情况下，两群都圈进去

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问为什么电泳的条带歪的，并且如何计算上样量？

小布丁瑶瑶

第一，所配制的胶有问题。比如:配方有没有错、浓度有没有错或者高低。凝固时间是否合适。第二，所配的电泳缓冲液问题。比如，配方浓度等是否正确。跟换缓冲液，重新配制。第三，电泳条件。电泳条件是否合适，电泳电压、电流和时间影响。电压是否稳定。这三者是出现电泳效果不好的主要原因。试着去改善，看能不能解决问题。当然了可能还有其他方面问题。

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问关于免疫组免疫荧光是选石蜡切片好还是冰冻切片好？中染色不均的，该如何考虑？

dxywode

免疫组织荧光，一定首选冰冻切片而非石蜡切片。两者的区别主要在于冰冻切片能较完整地保存抗原免疫活性，但组织结构会受到冰晶等的影响而变形，石蜡切片则相反。虽然石蜡切片可以做抗原修复，但是，它不是麻烦嘛！

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问在免疫组织化学的染色过程中，常用试剂的配制和使用？

dxywode

先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB 溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB 终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为 0.01%。

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问 PBS 的 pH 和离子强度的使用和要求？

此用户已注销

中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

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问怎样减少非特意结合？抗体已定

今天摆烂了咩

抗体浓度过高也可能导致此问题降低抗体浓度，可以减少非特异性条带

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问苏木精染色怎么配置？成品试过了，感染背景过厚

郭郭的郭郭

Gill改良苏木素（进行性染色）：配制时，先将2g苏木色精溶于250ml无水酒精，再将17.6g硫酸铝溶于750ml蒸馏水，然后两液混合后加入0.2—0.3g碘酸钠，最后加入15—25ml冰醋酸。此溶液为半氧化进行性苏木素液，不会产生沉淀，氧化膜少。常有人配制此液染不上色或染色较慢，可能是碘酸钠量的原因，可根据气温变化多加一点（气温在30℃时，一般碘酸钠量为0.25g，气温每降低5度，可增加0.

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问COIP研究蛋白互作过程中，待检测的蛋白分子量在55kD时，经常被抗体的轻重链挡住，有什么好的解决方案

txs900416

使用不同来源的抗体做ip和验证可以避免，如果所有抗体都是相同来源的，可以使用二抗为抗相应igg轻链的抗体验证

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问免疫组化怎么防止封闭过度

今天摆烂了咩

封闭不充分出现非特异性结合，可以延长封闭时间，同时担心封闭过度导致染色弱，这就需要封闭时间最好不超过十分钟，实验的具体条件最终还是要自己摸索的，可在十分钟范围内自行摸索一下最合适的时间再进行实验

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问一抗过程中无法足够一和目标蛋白结合 ? 细胞核显色不明显，靶细胞中没有目标蛋白? 切片本身脱蜡不彻底，如何解决?

郭郭的郭郭

1、洗涤不充分，膜没有洗干净。2、封闭不充分，一抗可能直接结合到膜上，造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。3、一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合。要解决封闭不充分这个问题，可尝试延长封闭时间，也可更换封闭液。常用的封闭剂有 5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等，推荐室温封闭 1 小时以减少背景。另外，脱脂奶粉常含有酪蛋白，由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此，检测磷酸化蛋白时建

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问二抗染坏了（非特结了），如何补救? 信号放大过度咋整? 染料和pbs在组织中互相作用的正确步骤?

dxywode

1) 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7．4)冲洗三次，每次3分钟(3×3’)。　　2) 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。　　3) 每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。　　4) PBS冲洗3×3’。　　5) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。　　6) 甩去血清

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问同一样品多次ELISA检测，测试结果差异大怎么解决？

peaceful13

样本的保存会影响蛋白的含量，尽量减少样本的反复冻融，并且测试时间间隔不可过长；其次elisa实验其实很多的是看样品含量趋势比较，如果要测试多次elisa实验的检测结果，那么最好有个校准的标品，再每次elisa实验时，校准产品检测出来的值差异需要在控制范围，这样确保实验间的差异变化也不过多影响最终样品值的确定

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问如果是做多克隆抗体，是免疫兔子好还是免疫老鼠好呢？如果是免疫老鼠，对小白鼠的品种有要求吗？

郭郭的郭郭

多克隆抗体一般通过免疫接种合适的哺乳类动物而产生，例如小鼠、兔子或者山羊。通常更倾向于采用大型哺乳类动物，因为可以采集更多的血清。一般选择兔子比较多，如果是老鼠的话，对种类一般没有要求。

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问石蜡切片抗体结合是否需要温箱孵育？

c_Yeats

1.一般一抗4℃过夜，二抗室温2.可以脱色后复染看看

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问包因溶液用什么替代呢

LFF520宣城

HNO3：HCl：H2O=1：1：1配备液替代

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问提取同一批小鼠肠道组织蛋白，蛋白浓度都不低，为了调整上样量，都调整了浓度，为什么有些样品连actin 都跑不出来？

颜渊溪桥

肠道组织属于平滑肌，用b actin坐内参不合适，换个内参gapdh试一下

3 回答893 围观

问最多能用几种抗体去筛选t细胞？

颜渊溪桥

我觉得主要看实验目的。胸腺中的不同时期t细胞及亚型可以用cd4，cd8，，cd25等筛选。次级淋巴器官及其他组织中可用cd3画总的t, cd4-cd8等往下画，然后再根据你所需要的亚型表征去泡，比如终末耗竭 pd1+ tim3+，只要流式通道允许，没有固定限制。

3 回答341 围观

问正常人的血清免疫电泳结果：免疫球蛋白（Ig）处于阴极端，离加样孔由近及远依次顺序是什么？

郭郭的郭郭

IgM离阴极端最近，然后是IgA，最后是IgG。

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问免疫细胞marker标记及panel确定

颜渊溪桥

如果你主要分析肿瘤样本中的免疫细胞群体，建议肿瘤组织研磨后percoll一下，下层70%，上层40%，离心后最上层是肿瘤细胞，中间是淋巴细胞，底部是死细胞。然后在去测淋巴细胞的胞内因子准一些。如果只染表面，可以不用percoll，但染色封闭处理一下对巨噬及DC等要好一些。

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