即用型免疫组化怎么具体操作

1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60℃恒温箱中烘烤 20 分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟,更换二甲苯后在浸泡 10 分钟 b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟 2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复 a 高压热修复 在沸水中加入 0.01m 枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 水浴锅加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至 95℃左右，放入组织芯片加热 10-15 分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔 5-10 分钟，胰蛋白酶使用前预热 37℃ 3、免疫组化染色 SP 法（1） 脱蜡、水化（2）PBS 洗 2-3 次各 5 分钟（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟（4）PBS 洗 2-3 次各 5 分钟（5）抗原修复（6）PBS 洗 2-3 次各 5 分钟（7）山羊血清封闭液，室温 20 分钟，甩去多余液体（8）滴加 Ι 抗 50μl， 4℃过夜或 37℃1 小时（9）4℃过夜后需在 37℃复温 45 分钟（10）PBS 洗 3 次每次 2 分钟（11）滴加Ⅱ抗 37℃1 小时（12）Ⅱ抗中可加入 0.05%的 tween-20. （13）PBS 洗 3 次各 5 分钟（14）DAB 显色 5-10 分钟，在显微镜下掌握染色程度（15）PBS 冲洗 10 分钟（16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗 10-15 分钟（18）脱水、透明、封片、镜检。 4、SABC 法（1） 脱蜡、水化（2）PBS 洗 2 次各 5 分钟（3） PBS 配制新鲜的 3%H2O2，室温封闭 5-10 分钟，用蒸馏水洗 3 次（4）抗原修复（5） PBS 洗 5 分钟（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟，甩去多余液体（7）滴加 Ι 抗 50μl,室温静置 1 小时或 4℃过夜或 37℃1 小时（8）PBS 洗 3 次各 2 分钟（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20 分钟（10）PBS 洗 3 次各 2 分钟（11）滴加试剂 SABC 20℃-30℃ 20 分钟（12） PBS 洗 4 次各 5 分钟（13） DAB 显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检。

1、石蜡切片，常规脱蜡至水
2、蒸馏水冲洗，pbs 浸泡5 分钟（如需采用抗原修复，在此步骤后进行）。
3、3%双氧水去离子水（无色液体）孵育15-20 分钟，以消除内源性过氧物酶活
性。
4、滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育15-20 分钟，倾去，勿洗。
5、滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2-3 小时或4℃过夜。
6、PBS 冲洗，3 分钟3 次。
7、滴加试剂B（黄色液体），室温或37℃孵育15-20 分钟。
8、PBS 冲洗，3 分钟3 次。
9、滴加试剂C（橙色液体），室温或37℃孵育15-20 分钟。
10、PBS 冲洗，3 分钟3 次。
11、显色剂显色（DAB 或AEC）
12、自来水充分冲洗。
13、如果需要，可进行复染，脱水，透明。
14、选择适当的封片剂封片。

1. 脱蜡、水化组织切片

2. PBS洗2-3次各5分钟

3. 根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理

4. PBS洗2-3次各5分钟

5. 加入100ul A 液孵育十分钟，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色

6. PBS洗2-3次各5分钟

7. 加入100ul B 液孵育五分钟来减少非特异性染色。注意：此步骤不要超过十分钟；如果一抗在含有5％至10％正常山羊血清的缓冲液中稀释，则此步骤可以省略

8. PBS洗2-3次各5分钟

9. 加一抗，室温或37℃孵育20分钟

10. PBS洗2-3次各5分钟

11. 加入100ul C 液孵育十分钟

12. PBS洗2-3次各5分钟

13. 加入100ul D 液孵育十分钟.注意：此液对光敏感，注意避光

14. PBS洗2-3次各5分钟

15. 配制新鲜底物液：将30ul的 F 液和1ml的 E 液充分混合，即配制成新鲜底物液（该底物液可存放2周）

16. 加入100ul新鲜底物液, 孵育五分钟

17. 去离子水冲洗

18. 复染，封片