实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问western blot 实验步骤的细节问题

府宅

注意事项1、转膜条件：对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，100V、冰浴45min足矣；对于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足够了；其他介于15-150kDa之间的指标100V、冰浴1h完全可以保证效果。2、转膜操作：准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡

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问为什么WB的条带很模糊？

whilt-shirt

是不是样本已经降解了，重新制备一批新样本试试；也可以调节成像系统的相机焦距试试

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问RNA提取需要注意的事项有哪些？

崔果儿

1.操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩，手套。2.实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。3.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free纪律二:阻止内源酶的活性4.选择合适的匀浆方法。5.选择合适的裂解液。6.控制好样品的起始量。7.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。8.RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不

3 回答797 围观

问western blot一定要内参吗？感觉内参变异很大啊

whilt-shirt

内参是需要的，根据不同的组织选择不用的内参。

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问WB跑出来的条带很浅？但是样品已经很多了，该怎么办？

whilt-shirt

更换抗体，或者重新制备蛋白样本，提高样本浓度

2 回答661 围观

问请问跑wb的一抗和二抗最多能重复用几次呢？如果配好了暂时先不用，放在-40℃冰箱能保存多久？

whilt-shirt

重复用的次数要视情况而定，常规的用10来次不成问题，配好的抗体一般在4℃条件下能保存2-3个月

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问石蜡切片和冰冻切片的比较？

崔果儿

手术台上当时取的叫（快速）冰冻切片，顾名思义，很快就出结果，医生在台上等候，根据病理科给出的冰冻切片的结果判断良恶性，从而确定切除范围。石蜡切片是术中切除的组织取一小部分，术后送病理科，由病理科在几天内（疑难时间延长）出结果，用于盖棺定论这个组织的良恶性，最为最终诊断。简单说，冰冻迅速而及时，但是有错误的几率，恶性判断为良性等；石蜡稳，病理科说是啥病外科医就认是啥病。

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问细胞提蛋白，有时候会出现胶状物，说明书说是正常现象，可以加点sds，但是加完依旧是胶状的，是什么原因？

whilt-shirt

换专用的提取试剂盒试试吧，这有可能是细胞数太多导致的

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问跑出来的杂带太多了，还有脱尾存在，杂质怎么去除？这么多去杂质的溶剂，放的先后顺序是什么？

whilt-shirt

要先确定实验过程中的所有操作步骤都是正确的，这样才能找到问题所在，杂带有可能是抗体浓度太高或者敷育时间过长都会导致杂带，或者更换封闭液可能会减少杂带

2 回答399 围观

问加了PMSF，为什么曝光出来条带和内参效果一样呢？

whilt-shirt

PMSF是蛋白酶抑制剂，是防止蛋白降解的，对内参和目的蛋白不会有影响。目的蛋白和内参效果一样可能是一开始实验就出了问题

1 回答329 围观

问哪种方法能够很好的进行蛋白印迹分析

whilt-shirt

常规用的是Western Blot，条带图用Image J 进行灰度分析

1 回答332 围观

问在免疫组化制片的时候有什么办法能让组织完整无刀痕？脑组织切片厚度多少才是最佳的？

菲菲飞呀飞

想要免疫组化制片的时候让组织完整无刀痕，必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为3~4μm，切好的切片在60℃温箱中过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，而产生抗原标记定位弥漫现象

3 回答435 围观

问关于细胞培养怎么选择更合适的培养基？

whilt-shirt

首先看购买细胞公司提供的说明书，如果没有，去各个公司官网查，再不行就各个培养基都试试，先用1640

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问何为黏附分子？？？？

青柠清心

粘附分子根据结构特点分为整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族、钙粘蛋白家族，此外还有一些尚未归类的粘附分子。功能：⑴参与免疫细胞的免疫发育与分化。如胸腺细胞发育成熟过程中涉及到胸腺细胞上CD8和CD4分子与胸腺基质细胞上的MHCⅠ、Ⅱ类抗原间的相互作用；T细胞活化分化过程中必须有粘附分子提供的细胞间协同刺激信号的存在。⑵通过白细胞与血管内皮细胞上的粘附分子之间的作用参与炎症过程 ⑶通过淋巴细胞

3 回答615 围观

问coip后的结果，怎么判断我的目标蛋白和ip得到的蛋白一定有相互作用呢？

刹那芳华2333

免疫共沉淀（Co-IP）是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础，用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法。利用免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用，或者利用已知蛋白寻找与之相互作用的未知蛋白，通过wb的阳性条带来判断是否发生互作

3 回答670 围观

问小鼠干细胞怎么培养？

丁香粉猪猪

一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。

4 回答650 围观

问骨组织wb内参不齐怎么整？

whilt-shirt

蛋白浓度一样不代表内参浓度一样，我们实验室一般现用BCA法测总蛋白浓度，第一次上样后根据内参调整上样量，这样内参就齐了

2 回答484 围观

问新手小白第一次如何设计siRNA、shRNa相关序列？

bamboopiggy

第一次，最好是按照参考文献来，你做的rna一般应该有人做过。如果实在没有，有在线的si和sh的设计软件可以用，thermo官网上就有

3 回答698 围观

问RNA跟DNA的区别？

菲菲飞呀飞

RNA又称核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成，RNA的碱基主要有4种为腺嘌呤，鸟嘌呤，咆嘧啶，尿嘧啶，RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成一条单链，它的主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达。DNA又称脱氧核糖核酸，它的主要功能是长期性的信息储存，DNA的复制方式为随机半保留复制。

4 回答615 围观

问做实验老是没有重复性，不能确定自己操作准确，很苦恼，也不知道操作问题还是实验确实不行。有没有大佬指点

whilt-shirt

换个人同样的操作，或者自己一步步操作，找师兄师姐在旁边督促看看

2 回答279 围观

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