大分子量蛋白（470kDa）如何快速转膜？

Tris- Acetate gel电泳，低浓度甲醇冰水浴湿转。欲速则不达。

可以考虑选择快速转膜液，高电流转膜

因为多数大分子蛋白是膜蛋白，表达较少，建议适当增加上样量，并延长一抗孵育时间。

大分子蛋白与PVDF膜的结合不是很牢固，容易脱落，洗膜时要操作轻柔，不要过于粗暴，否则抗原抗体复合物容易脱落。

恒压40V电压，转膜60-90min，一般小于400KDa的蛋白都能转到PVDF膜上。恒流法转，电流大小设置为PVDF膜的面积，转1小时左右即可，若怕转膜过头，可以将两张PVDF膜重叠起来。建议转膜后，使用丽春红染液染膜（Invent Cat# WA-004），检验转膜效率，蛋白条带分布和上样量如何，如果染色后无条带，则需考虑样品问题及转膜问题，进行调整。

不同分子量的蛋白质选择的凝胶浓度和转膜时间也是不同的，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，转膜时间较长，而低分子量蛋白用高浓度胶分离，采用较短的转膜时间

提蛋白时应加入RIPA强效裂解液，在4℃环境下静置的时间延长十分钟到二十分钟。这样可以充分裂解大分子蛋白。

转膜时，湿转法与半干转法均可以（湿转法获得条带漂亮。半干转转膜效率高），转膜时，要保留分离胶。