跑磷酸化蛋白有什么要特别注意的吗？出来的条带不明显，几乎看不到。

1.收集细胞在冰上，加入磷酸酶抑制剂。足量裂解液。

2.超声样本，促进蛋白溶解。

3.增加上样量到40ug.

4.根据推荐的方法稀释抗体。

5.洗膜 TBST 5分钟三次。

6.确定总蛋白是否有表达。然后排查该位点磷酸化是否被诱导，是否在合适的检测窗内（多设时间段）。用成熟的诱导Model制备阳性对照，可能你的模型或者样本里这个位点就是没有被磷酸化。

加入充足的磷酸酶抑制剂，并始终将样品置于冰上，使蛋白保持在磷酸化的状态。

使用 5% w/v BSA 而非牛奶（牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白；而抗体会检测牛奶中的酪蛋白导致高背景）封闭膜。

磷酸化可能需要被诱导。信号弱或无信号可能意味着诱导不充分。建议使用推荐的阳性对照。

在提蛋白过程中加磷酸酶抑制剂，蛋白浓度定的高一点，上样量多一点