3 个回答
staywalking
有帮助
1.收集细胞在冰上，加入磷酸酶抑制剂。足量裂解液。
2.超声样本，促进蛋白溶解。
3.增加上样量到40ug.
4.根据推荐的方法稀释抗体。
5.洗膜 TBST 5分钟三次。
6.确定总蛋白是否有表达。然后排查该位点磷酸化是否被诱导，是否在合适的检测窗内（多设时间段）。用成熟的诱导Model制备阳性对照，可能你的模型或者样本里这个位点就是没有被磷酸化。
毛桃子啊
有帮助
加入充足的磷酸酶抑制剂，并始终将样品置于冰上，使蛋白保持在磷酸化的状态。
使用 5% w/v BSA 而非牛奶（牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白；而抗体会检测牛奶中的酪蛋白导致高背景）封闭膜。
磷酸化可能需要被诱导。信号弱或无信号可能意味着诱导不充分。建议使用推荐的阳性对照。
whilt-shirt
有帮助
在提蛋白过程中加磷酸酶抑制剂，蛋白浓度定的高一点，上样量多一点
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