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问
做qpcr的时候要有什么操作注意事项
dxy_gwrp7ndq
1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染,RNA提取和反转过程中应小心谨慎。2. 操作过程中避光,冰上操作。3. cDNA模板避免反复冻融,否则会引起模板的降解。4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。
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问
免疫荧光细胞化学双重染鱼法中,两种一抗在混合稀释时怎么保证最终浓度?
dxywode
进行双重染色时,由于两种一抗种属来源不同,可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗,滴加二抗时,先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育,洗涤后,滴加SABC-Cy3复合物,经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光,再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育,最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光,B抗原呈现红色荧光。此法应注意两种一抗在混合稀释时,抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之,混合后
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问
DNA在什么条件下保存?
whilt-shirt
一般是-80℃保存,但是短期内用完的话可以放4℃
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问
DNA提取的要求是什么?总是实验失败,大家告诉一下
whilt-shirt
主要是无菌操作,尽量选用进口的试剂盒
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问
Western Blot实验,条带信号弱,难以分辨,怎么改进呢
whilt-shirt
加大上样量或增加上样浓度,更换新抗体或加大抗体浓度
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问
如何取微小组织进行WB?
Amor良
可以选择0.2μml的膜,同时缩短转移时间。
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问
Western Blot杂带太多的原因是
今天摆烂了咩
杂带多的原因——上样量过高,蛋白样本降解,蛋白本身有多个修饰位点,抗体未纯化,一抗浓度过高,洗涤不完全,封闭不好等都可能导致杂带产生。
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问
跑带,条带上有圆形的白孔?
岳努力岳幸运
感觉像是湿转的wb。最可能的原因是在转膜操作的时候,SDS-PAGE胶和pvdf或者nc膜中间有小气泡。在电转液中将夹板里的海绵和滤纸都充分浸湿,而且电转液的量应该足够淹没膜,把胶放在膜上的时候沿着一边放下去,可以轻轻刮排气泡。最后把滤纸海绵都盖好后,为了万无一失,最好用圆管在上面滚一滚充分排出小气泡!
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问
免疫荧光我想染3种蛋白,需要准备哪些?抗体和试验鼠。
whilt-shirt
需要对应的抗体,相关的试剂,除DAPI以外的三种波长的二抗
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问
如何提高蛋白质提纯效率?
whilt-shirt
采用进口的专用试剂盒会提高提纯率
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问
死细胞对rna提取有影响吗
whilt-shirt
死细胞影响不大,在提RNA过程中主要还是看活细胞
4 回答
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问
薄层色谱法点样应该注意些什么?
举个栗子ok
样品溶液浓度不能太稀,同一板样点间距离合适。
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问
血细胞吞噬实验总是失败,荧光染色后没有发现吞噬现象
vae1476
细胞吞噬实验对细胞活性和状态要求很高,需要进行细胞活力考察
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问
Fluo4 AM检测细胞质内钙离子浓度,钙离子探针荧光微弱?
dxywode
Fluo-4 AM(钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存母液,浓度为2mM。用于细胞内钙离子检测时,Fluo-4 AM的常用浓度为0.5-5 μM。通常用含有0.5-5μM的Fluo-4 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育10-60分钟进行荧光探针装载,随后适当洗涤,洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内充分转变成
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问
用的为特异性一抗,但是对照样品却跑出来相应位置的条带,是什么原因?
whilt-shirt
有可能是样本污染了,也有可能是抗体浓度过高
4 回答
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问
如何保证GFP嵌合体监控蛋白质和蛋白质相互实验完整进行
dxywode
可以选用非变性聚丙稀醜胺凝胶试剂
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问
如何收集带flag标签的蛋白?
wuli猫宁
可以参考本链接,个人认为讲的很全面。【Flag 、HA、GFP标签蛋白纯化介绍】https://mr.baidu.com/r/CYK6W8o4ko?f=cp&u=6f9e5f2331512afd
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问
跑胶时候RNA的浓度多少比较好?
wuli猫宁
【跑胶_RN(浓度、纯度测定)】https://mr.baidu.com/r/CYMO5CUEIU?f=cp&u=1977c84f168fdd41此视频较详细,可以借鉴。
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问
跑蛋白的时候,蛋白条带很黑,请问如何解决?
vae1476
抗体特异性不高会导致这种情况,另外提高封闭时间有利于解决
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问
Elisa实验本底颜色太重什么原因?
wuli猫宁
1、实验过程中洗涤不充分,洗后未拍干,样品观中其他成分残留或酶标记物残留解决办法:充分洗涤,静置15秒,彻底拍干。加样和加酶的拍板的滤纸应弃去不用,不要重复使用,以免被污染。2、样品稀释液污染解决办法:弃去稀释液,重新配置。3、没有正确封闭解决办法:在样品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间就知道这么多,求其他解答。
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