• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        RNA干扰提取RNA注意事项?

        user-title

        highhill2000

        RNA干扰试验提取RNA需要注意什么?

        wx-share
        分享

        3 个回答

        user-title

        迟C迟

        有帮助

        ① 使用无 RNase 的塑料制品和枪头,玻璃器皿要消毒,避免交叉污染;使用性能较好的移液器,如 Eppendorf、Thermo 等;

        ② DEPC 有剧毒,小心配制;配制溶液应使用无 RNase 的水;

        ③ 操作人员应戴一次性口罩和手套,实验过程中要勤换手套;

        ④ 样品应避免反复冻融,否则影响提取 RNA 提取得率和质量;

        ⑤ 若下游实验对 DNA 非常敏感,可用不含 RNase 的 DNase I 对 RNA 进行处理。

        user-title

        府宅

        有帮助

        1. 避免使用抗生素

        Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转染效果。

        2. 选择合适的转染试剂

        针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。

        3. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

        对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

        4. 通过标记siRNA来优化实验

        荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来

        user-title

        dxy_gwrp7ndq

        有帮助
        1. 纯化siRNA

        在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。

        2. 避免RNA酶污染

        微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

        3. 健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

        通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。
        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序