实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问大分子WB的信号如何跑好？

邓豆豆逗

可以配置8%的分离胶跑，转膜可以考虑300mA恒流40min 做好降温，同时可以提高上样量和抗体浓度

5 回答1652 围观

问蛋白加Loading煮了以后变色会影响实验吗？

bqejjh123

你的样品有什么特别的成分，一般Loading加进去变红是因为样品太酸，加入2ul氢氧化钠即可，如果样品沉不下去，适当加些甘油增加密度。

4 回答1885 围观

问提取的核蛋白wb条带多条带怎么办?

邓豆豆逗

提取的核蛋白可以做一下GAPDH看看，如果能检测到条带，说明提取的核蛋白不纯，存在胞质蛋白的污染，可以考虑碧云天的核质分离试剂盒

5 回答353 围观

问请问怎么高效地提取膜蛋白？

dxywode

使用离心管柱分离技术起始材料仅需 undefined107 个细胞，即可将细胞 / 组织分离为细胞浆，细胞核，细胞器和质膜组分。离心管柱带有特定孔径和表面性质，当细胞通过离心管柱，细胞膜被破裂分离出完整的细胞核，随后通过差速离心和密度离心分离出质膜蛋白，无需使用超高速离心。

3 回答377 围观

问求再做WB实验时，最后跑出来两条清晰的条带，可能的原因有哪些呢？

未来9

有可能是同一个蛋白的磷酸化与为磷酸化的形式，分子量很接近！或者是甲基化等等！

3 回答881 围观

问我的条带很浅显不出来怎么办？分子量也不小大约26kda

dxywode

转膜条件是否合适，先需要确定蛋白成功转至膜上一抗和二抗的比例，是经过尝试的么，有没有提前在ELISA上验证反应性。曝光显色试剂是否失效，尽量使用新鲜有效的。

3 回答173 围观

问ChIP实验中最关键的结果是什么？什么样的富集倍数被认为是阳性的结果？

whilt-shirt

染色质免疫共沉淀（ChIP）实验本身其实就是一个通过免疫沉淀反应验证蛋白与DNA相互作用的实验。因此结果一般包括两个数据：免疫沉淀的效率（富集效率）, 蛋白与DNA结合能力（富集倍数）。但是这两个结果本身都是一个相对值，因为富集效率就是断裂后的染色质分成两部分，一部分进行免疫沉淀，一部分作为对照不进行免疫沉淀，然后两者进行比较，得到一个百分比。富集倍数就是取两个抗体进行免疫沉淀，一个是特异性的抗体

1 回答621 围观

问每次用配好的胶，跑胶电泳时，跑出的maker为什么总是歪歪扭扭的？

未来9

可能是边缘效应，两边的胶有可能没凝固好，或者是两边胶不匀而引起的，可以上样时留出两边的孔。

5 回答2427 围观

问WB跑电泳时候，肉眼可见蓝色的loading不在一条线上是为什么？是因为胶配的不好吗？

未来9

样品处理问题吧？有时制胶不好也可以，有时是电泳液的原因不一定会影响最终的结果吧

5 回答997 围观

问WB实验，同一个样品，上样体积都一样，但在不同的孔上样，显影后，每个孔的灰度值却不一样。最左边的孔显影出来的灰度值总是最浅的。

邓豆豆逗

转膜效率不一致，可以更换海绵和滤纸，同时将胶和膜尽可能的放正中间；或者孵育一抗或二抗时膜的一端有翘起来或者贴在孵育盒上了，导致抗体孵育不充分，从而导致边上条带偏淡。

4 回答854 围观

问10%的胶，恒压80V跑浓缩胶，120V跑分离胶，120V转膜2小时

sing生物狗

其实这个是胶的原因可能性大，建议充分混匀，跑的电压应该没问题的

3 回答489 围观

问为什么wb条带的位置和kd值不一样

未来9

首先，SDS-PAGE电泳时分子量marker不能作为绝对标准，只是一个参考值。其次，有的蛋白（如组蛋白和一些易形成dimer的蛋白，还有一些比较难变性而又形成紧凑的球形结构的蛋白）在用常规方法电泳时会出现异常行为（表观分子量与实际分子量不符）。以前对于这个问题,似乎听实验室的师兄说,SDS-PAGE鉴定表达的外原蛋白,分子量和Marker有一定的出入,一般在10kD左右浮动还是可以接受的,也许就

5 回答1012 围观

问切分子量大的比如280的怎么避免歪歪扭扭，配胶注意点？

whilt-shirt

选择6%的SDS-PAGE胶跑蛋白，增加转膜时间和转膜电流

3 回答155 围观

问实验中漏胶一般是什么引起的，怎么解决

sing生物狗

有可能是架子用的时间久了就会松，可以在上面夹一个1ml的枪头

5 回答406 围观

问测定蛋白质含量用考马斯亮蓝法更好些还是酚试剂法更好些？为什么？

bamboopiggy

两个方法都可以，但是酚试剂步骤更简单一些。

3 回答821 围观

问本人纯化his标签蛋白，无论如何更换表达感受态和诱导条件，蛋白表达量都很低是什么原因？使用载体为32a，和28a都不理想

天一湖医者

a可能原因：超声功率不合适(太大，蛋白碳化，太小，蛋白没完全释放)解决方法：改变超声功率或者其它方法破碎细胞。b.样品或缓冲液不合适解决方法：确保缓冲液中螯合剂，还原剂，咪唑浓度不是很高。c.His标签暴露不完全解决方法：在缓冲液中加变性剂(4-8M尿素，4-6M盐酸胍)，然后用IMAC介质纯化。d.His标签丢失解决方法：必要时增加His的个数并确保正确表达，同时降低上样速度，确保足够的孵育时间

2 回答917 围观

问bca定量总蛋白一致内参tubulin不一致

邓豆豆逗

更换内参再试试，如果差异还是很大，说明定量结果不准，只能根据条带亮度进行上样量的调整了。（bca定量结果只能作为参考，不能作为你内参一致的依据）

6 回答1208 围观

问western blot实验条带颜色整体都很深，是什么原因造成的？做完了还能再改进么？

邓豆豆逗

可能原因有很多，你可以逐个排查:1.封闭时间不够或封闭液不行，建议用5%脱脂奶粉封闭，封闭时间至少1h；2.洗液被污染或一抗和二抗洗涤不充分，建议更换新鲜洗液，同时延长洗涤时间和次数，比如增加到5次，每次5mim；3.ecl发光液是超敏ecl，可以用tbst稀释一下或者用普通ecl曝光；4.pvdf膜被污染，操作过程中一定不能用手碰到膜，很容易粘上脏东西被污染；5.如果是组织提取蛋白做实验的话，可

7 回答2429 围观

问为什么其他方式能验证出两个蛋白之间有相互作用，用Co-IP却没有验证出来？

whilt-shirt

首先确定两个蛋白到底有没有相互作用。可以结合酵母双杂交，LUC或者其他的实验结果。在其他实验验证有互作的情况下，调整COIP 条件。看来你的步骤，其中孵育的时间两个overnight，太长了如果某个蛋白不稳定你这两三天的实验蛋白就降解了，加抗体后2h，加proteinG beads再4h就可以了，不需要太久。另外完全可以适应标签抗体偶联好的商业化Flag beads or HA beads, 这样

3 回答787 围观

问ChIP实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的NDA操作上最大的区别是什么？

whilt-shirt

实际操作上就是转录因子的必须要用甲醛固定，组蛋白看情况，在组蛋白表达的多的情况下可以不使用甲醛进行固定。其余过程就是解交联的时间，组蛋白要适当的增加解交联的时间。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行

2 回答521 围观

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