实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问WB时怎么选择合适的内参蛋白呀

迟C迟

（1）根据样本的种属来源选择，如哺乳动物或者植物等（2）考虑目的蛋白的分子量大小，一般需要与目的蛋白的分子量相差5kd以上（3）根据蛋白表达位置选择不同的内参，不同的细胞器中选择的内参也不同

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问做wb的时候内参条带不齐，

未来9

单独上样可以出现，可以排除蛋白本身的问题，但混合一起加时却跑的不齐，最大的可能就是胶的问题，胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。再就是抗体孵育问题，不知你是用孵育盒，还是用封膜孵育，一定要保证膜与抗体充分接触，保证孵育效果。三是显影剂是预混还是混合好的，注意混合比例

4 回答6775 围观

问如何有效控制内源酶的活性呢？

迟C迟

方法有很多。比如如果是提取RNA,可以通过低温。如果是提蛋白，可以加入蛋白酶抑制剂等等，这些实验步骤都很成熟了。

3 回答545 围观

问WB实验条带异常问题？

vae1476

这种一般是胶不均匀的问题，等下层凝住了再加上层，会好一些

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问包涵体沉淀（σ32)的溶解、重折叠和离子交换层析实验时

迟C迟

每 4 h取 150 ul 样品，用反相高效液相层析 (HPLC) 测定去垢剂含量，这样可以确定透析去除 SKL 需要多长时间和加到离子交换柱的样品中有多少去垢剂存在。

3 回答417 围观

问蛋白质印迹免疫分析时，蛋白质如何转膜？

bamboopiggy

三明治夹心法，将滤纸胶膜滤纸，制成三明治夹心的方式，然后分干转和湿转，看你的仪器。

3 回答477 围观

问WB条带大小和预期差别大，变性后的样品大蛋白降解快怎么办呢？

天一湖医者

确定蛋白是内源的还是外源的，如果是外源蛋白是不是全长序列SWISSPROT 数据库查询该蛋白是否有其他 isoform； SWISSPROT 和文献查询蛋白质是否有剪切活化，剪切活化造成蛋白变小；确定蛋白质是否是二聚体或多聚体。 NCBI 和 SWISSPROT 查询蛋白质表达后是否有修饰，如有修饰会导致蛋白质增大；

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问做WB中裂解液与细胞的比例？

bamboopiggy

6孔板长满，大概用100-200ul收，就可以测浓度。组织的话，一般是1mg:100ul就可以。脑组织的话1:50更好

5 回答3956 围观

问蛋白样品变性后能保存多久？多久后使用不影响？

未来9

-80,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)

5 回答4069 围观

问表达标签蛋白的时候，蛋白标签放在哪段？

水木杰

如果没有信号肽的话，n端和c端同时做，综合表型来看，哪个做出来用哪个，都做出来首选c端。当然，这两个都不行的话，只有放中间了

5 回答14083 围观

问关于膜蛋白SDS-PAGE电泳？

dxywode

先做个western确定下目标蛋白是否表达？因为膜蛋白表达量教低，即使过量表达也只有1mg/l 甚至更低 SDS检测不到很正常。保证每步都加PMSF或者相应蛋白酶抑制剂避免被降解。换表面活性剂。不同膜蛋白适用的表面活性剂不同参考文献的选择吧。不过没有参考的话一般DDM是优先选择的。尤其对于a-helix膜蛋白。

4 回答1482 围观

问6.5%的EMSA 胶为什么100V跑一个半小时才能跑到1/2，理论上不应该半小时就跑到吗

dxy_gwrp7ndq

可能是电泳环境的问题，一般电泳大约50-60min，可以根据实际情况调整电泳时间及电压，而且电泳时间不宜过长

2 回答1079 围观

问coip实验中从免疫磁珠上洗脱相互作用的蛋白时，怎样才能只洗脱下来相互作用的蛋白，而不将磁珠上的抗体也洗脱下来？有专门的洗脱液吗

天一湖医者

可在洗脱之前加一步水洗，也可以有效降低洗涤液残留对磁珠洗脱效果的干扰。

2 回答751 围观

问在做聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳时经常出现图中条带弯曲情况，影响文章质量，如果改变这种情况，怎么才可以让条带变直

生物小硕硕

可以在电泳加样之前空泳道电泳一会，使离子平衡

4 回答1073 围观

问wb跑胶出的条带为什么最上面还有条带？

dxywode

你可以尝试减少上样量，增大一抗稀释倍数。

3 回答269 围观

问我要标泛素化和非泛素化的FANCD2，用5%的脱脂牛奶封闭标不出来，2X或者3XBSA可以标出非泛素化的，但是很脏，怎么改进条件

dxy_t7p3th22

封闭可以用5%的BSA，加大上样量和抗体浓度

3 回答306 围观

问Co-IP实验如何避免出现假阳性？

未来9

Co-IP选择抗体尤为关键，特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。同时可以结合Co-IP反向验证进一步排除假阳性。若抗体浓度过高，则降低抗体浓度；若抗体特异性不好，则更换抗体。

2 回答426 围观

问Co-IP实验对抗体有什么要求

未来9

抗体的选择十分重要，选经过 IP 验证的抗体，可以减少假阳性概率。

3 回答798 围观

问谷类蛋白质凝胶在实际生活中有那些应用？

未来9

对各种水进行过滤、分离，从而对水质进行纯化处理。

3 回答569 围观

问常用的蛋白纯化标签有什么特点？如何选择？

未来9

蛋白标签大体可分为三大类：遗传标签、in vivo标签和in vitro标签，最为常用的是遗传标签，即c-Myc、FLAG等。通过将目的基因克隆到含有标签的载体上，方便在下游通过抗体、荧光检测蛋白，或对蛋白进行纯化如何选择：1. 首先需要确定融合标签的目的，蛋白纯化首选His-Tag，Western blot首选Flag-Tag，免疫共沉淀可选择Flag-Tag或其他常用标签如HA、cMyc，活细

3 回答1430 围观

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