实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问有木有人教学一下大分子量的蛋白应该如何操作呀？

未来9

250kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。

4 回答468 围观

问聚丙烯胺分离胶相关问题请教

whilt-shirt

6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD

6 回答1428 围观

问对蛋白质分离纯化时，如何能够取得纯度高和总回收率高的

Kimser

诱导时间最好提前做一下预实验，可以先试试25或者30℃附近，这样可以提高纯度和回收率

6 回答727 围观

问免疫组化量化的过程用imagej总是觉得不准确有什么办法呀？

未来9

重复实验再试试，对比imageJ结果来看

3 回答508 围观

问如何有效捕捉蛋白印迹图片?

sunny陈520

有效捕捉是让蛋白最佳显色吗？我们实验室用的是荧光显色，所以直接显色就可以了，现在很多仪器是自动曝光，也会自动选择最佳曝光时间，如果是暗室的话，需要根据蛋白曝光程度，如果很容易曝光，几秒就可以了，如果很难显色，可能压片的时间要长一点

6 回答432 围观

问蛋白印迹定量分析常用软件？

sunny陈520

ImageJ常用，也通用，也可以用仪器上的软件，看个人需求了

8 回答463 围观

问HepG2 细胞是沾染细菌了吗？

dxy_gwrp7ndq

1,先用血平板做细胞培养排除细胞污染2,如果没有细菌生长那就是你的细胞在传代过程中没有及时更换培养基3,解决办法是:用胰酶消化细胞株,换瓶传代即可

5 回答427 围观

问样品脂肪含量太多，需要增添什么步骤？

dxy_gwrp7ndq

脂肪类较多的会采用正己烷萃取等办法去除。

3 回答325 围观

问cDNA法推断蛋白质一级结构时，引物有哪些设计要求，需要注意的问题？

府宅

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq D

3 回答564 围观

问请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开?(当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉)

崔果儿

大多用凝胶过滤，这也不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此蛋白选择sephadex G50试试，它的范围在1000-30000，应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。

2 回答404 围观

问想用荧光抗体对组织免疫染色，能染出梯度吗？如何对梯度分布的分子进行染色？

天一湖医者

可以的，通过调控镜片在染色液里上下运动的时间的方法进行。

2 回答206 围观

问q PCR为什么一定要跑溶解曲线？在数据分析这一部分也用不到溶解曲线。

天一湖医者

用来判断产物是否相对专一。溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解线，随着反应中双链DNA变性。

3 回答2037 围观

问线虫寿命曲线应该如何制作

府宅

秀丽线虫进入成虫期开始产卵后，每天将秀丽线虫转移至新的培养基上。待10d后每天记录秀丽线虫的存活、死亡和丢失的数量。死亡判定标准为铂金丝轻轻碰触秀丽线虫半分钟不动则为死亡；当秀丽线虫在培养皿壁上干、体内有子代孵化导致死亡的排除在外不计入死亡数内。收集每日数据，绘制寿命曲线

3 回答2921 围观

问Co-IP实验成功的评判标准是什么？

府宅

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。假如细胞内存在XY蛋白复合物，用X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也被沉淀下来。沉淀经多次洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸后离心收集上清，对上清进行免疫印迹（Westernblot，WB）检测Y蛋白的存在，如果Y出现，则说明蛋白X与蛋白Y存在相互作用，CO-IP实验成功。

3 回答432 围观

问Co-IP需要准备多少样本量？

天一湖医者

1. 细胞＞1×107；组织＞100mg；细菌湿重＞1mg；植物＞100mg；血清＞50ul2. 样品蛋白浓度＞1mg/ml，蛋白量＞200ug/样品

3 回答1889 围观

问蛋白不表达或表达量很低，怎样快速选择最合适的表达载体？

天一湖医者

根据你的实验目的确定你所需要的表达量，是采用一个含有强启动子的载体来过量表达蛋白，还是只需要一个普通的启动子即可。根据上述原则初选出一些载体，然后找到这些载体的使用说明书（直接在网上找），里面有非常详细的说明，包括启动子信息、多克隆位点信息、载体使用范围、表达条件等。

4 回答534 围观

问小鼠附睾脂肪的组织染色需要特殊的固定液么？需要做冰切，HE染色。目前是直接放在4%PFA里。有什么固定液配方吗？

dxy_gwrp7ndq

4％多聚甲醛（ PFA ）的配制方法：1L: PFA 40g0.1M PB ( pH 7.4）先加入500∽800ml，加热至60℃，磁力搅拌使粉末完全溶解，再稀释至1L.* IL 0. 1M PB ( pH 7.4)： A : NaH2PO4 .2H2O 2.96362g B : Na2HPO4 .12H2O 28.99476g或Na2HPO4 11

3 回答1895 围观

问如何有效分析RNA-seq的结果?

天一湖医者

可运用转录水平分析RNA-seq数据的一个重要用途是基于短RNA-seq读数恢复全长mRNA转录物结构和表达水平。目前有许多计算工具同时执行转录重建和量化。1、基于似然法的分析方法。第一种类型的转录物定量方法通过基于统计模型最大化可能性或后验来估计转录物丰度。这些方法是灵活的，并且可以容易地修改以将先前的生物信息结合到后部以提高量化准确性。统计模型进一步分为三类：基于区域的，基于读的和基于片段的模

3 回答1024 围观

问酶联免疫吸附试验是敏感性很高的一项技术实验，实验过程有哪些需要注意的？与其他实验相比有什么优点？

府宅

注意事项：1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。2.包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考

3 回答703 围观

问Co-IP中没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或检测得到的信号太弱的原因有那些？

dxywode

3 回答296 围观

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