实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问利用Ni－NTA纯化蛋白的buffer，里面的咪唑成分大概能保存多久？

天一湖医者

2-8度避光一般可以保存2年。

3 回答882 围观

问请问特异性抗体常常出现不明的非目的条带是为什么呢？定量后的蛋白样为什么会出现有目的蛋白但无法敷育出内参的情况呢？

Kimser

非特异性条带可能是蛋白量较大，可以适当减少，也可能是蛋白不够新鲜，导致蛋白降解较多，可以更换新鲜蛋白。无法孵育的原因可能是孵育时间不够，考虑温度的原因可以适当延长孵育时间。

4 回答709 围观

问为什么有时候浓缩胶和分离胶之间有气泡，会影响实验结果吗？

丁香粉猪猪

先倒分离胶,然后加0.5ml水在分离胶上，等到分离胶凝了，再倒浓缩胶。这样不会起泡

7 回答782 围观

问用新的镍珠纯化蛋白，目的蛋白为什么挂不上珠？

天一湖医者

1. 因为 His标签被包到了蛋白三维结构里面。镍介质无法接触His 标签；2. 纯化工艺不利于结合作用发挥，例如咪唑；3. 蛋白不稳定，标签掉落

2 回答4212 围观

问想要筛选差异蛋白，怎么选择合适的技术呀？

丁香粉猪猪

可将经典学派的策略分为基于分布假设和基于传统非参数检验策略两类。（1）基于分布假设的统计策略基于分布假设策略的一般步骤可总结为：1）假设数据集服从某种特定的分布；2）建立统计模型、构造统计量；3）计算 p 值、确定阈值，比较得出结论。研究某蛋白质在两种状态下表达水平差异的显著性，相当于检验两组数据的均值是否存在差异。而 t 检验是统计方法中发展较成熟的、用于分析两组样本间均值差异的方法，t 检

5 回答466 围观

问wb条带曝光后两端颜色深，中间颜色浅，呈有过渡的渐变色是为什么？

丁香粉猪猪

转一个样也能中间淡两边深？如果大家都一样的问题，很可能是仪器问题

3 回答2754 围观

问提蛋白时要不要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂？

vae1476

提蛋白，尤其是需要看磷酸化蛋白的时候，需要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂

5 回答5700 围观

问磷酸化蛋白一定需要诱导吗？是否有具体例子或者基线表达或诱导方法的综述？

Kimser

不说一定，很多情况下蛋白磷酸化是比较低的，需各种手段去刺激磷酸化表达。具体例子或综述很多，你去知网一查就能看到这里就不好打广告了

3 回答387 围观

问300kd大小的蛋白分子转膜时间如何控制呢？

迟C迟

相对来说，大分子蛋白用湿转更好。如果想快一点就加大电压，正常两个小时差不多。

7 回答5589 围观

问做荧光定量PCR和半定量PCR有什么区别？半定量的PCR退火温度和荧光定量PCR是一样的吗？

迟C迟

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的，但二者检测的东西多少有些不同。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料（SYBR green）或者和目的DNA片段结合的荧光探针（taqman)，通过监控PCR过程中的荧光的变化，并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量。荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时

3 回答5599 围观

问请问做实时荧光定量PCR实验时，为什么做标准曲线？可以不做标曲吗？实验新手，求指导！

迟C迟

做标曲才可以算出这对引物的扩增效率（其斜率），方便用pfaffl方法来进行相对定量（得到的结果相对精确一点），否则只能默认扩增效率为2，用2^-ddCt(Livak)法来计算，做标曲才可以绝对定量。

3 回答1086 围观

问TaqMan荧光探针和SYBR Green荧光探针怎么选择？

迟C迟

TaqMan荧光探针和SYBR Green荧光探针更准确。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收

3 回答1692 围观

问荧光定量pcr TaqMan探针，标准曲线不好，ct值没有按等差数列增加，怎么办？

迟C迟

这个应该是你的模板没稀释准确，或者浓度不合适，如果是数据不成直线，全还是很平滑的曲线，可以勉强用曲线处理。如果不平滑，R方值很小，恐怕结果不太可靠了，只得重做，如果不能重做，只能舍弃不好的数据，用另几个数据得到方程，算出结果，但结果的可靠性就差了，只能对付一下。

3 回答458 围观

问各位前辈，WB蛋白定量怎样缩短时间呀？我总是1个多小时，太耗时间。

天一湖医者

蛋白定量法开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法： BCA，Bradford，双缩脲法（Biuret 法），Folin 法（Lowry 法）和紫外分光光度计法。BCA 法的原理是在碱性条件下，氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物，测定 562 nm 的 OD 值，所以如果样本里有还原剂（比如 DTT）的话就会对 BCA 的结果产生干扰。Bradford

5 回答319 围观

问WB条带曝光的时候，有一大部分阴影覆盖在条带上，是什么原因

丁香粉猪猪

原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5miundefined5次，不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不

4 回答629 围观

问一个新蛋白，制备多克隆抗体时，抗原设计表达重组蛋白选择的氨基酸序列原则是什么？

vae1476

分析蛋白性质性质和特点，根据实际应用目的制定抗体，有以下原则：1）基本性质分析:查看蛋白质修饰情况（糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等）、结构域特点、剪切加工等情况，如果蛋白质有后加工，应该尽可能选择一个完整“成熟体”区段进行分析。常用网站：(Http://www.uniprot.org)。2）分析跨膜区分析：进行跨膜分析最常用的网站（http://www.cbs.dtu.dk/services/T

3 回答375 围观

问组织TNF-a表达用什么方法看

vae1476

可以用免疫组化，免疫荧光看，比较直观，也可以裂解成细胞，RTPCR或者WB来看

3 回答393 围观

问想请问一下大家，检测磷酸化蛋白表达量变化的WB实验，除了加磷酸酶抑制剂之外，怎么操作可以让磷酸化蛋白更好跑出来呢？

Kimser

因为磷酸化是个可逆过程，所以除了磷酸酶抑制剂，还需要跟时间赛跑，新鲜和短时间流畅的操作会减少磷酸化的变化。当然，抑制剂仍然是关键所在，不过要注意对不同蛋白，磷酸酶抑制剂也不同。

3 回答1093 围观

问请问，敷抗低温过夜和常温2h，效果差别大吗？

天一湖医者

差别很大的，建议低温过夜，常温2小时有有可能会不显！

5 回答366 围观

问southern blot 的限制性内切酶怎么选呀，为什么我酶切跑胶，啥也没跑出来？

vae1476

在目的基因上选取一段作为探针。注意探针的特异性，选择一个探针序列内部没有的就可以作酶切位点

3 回答616 围观

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