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问
小白第一次做免疫组化,该选哪种做法最稳妥啊,两步还是三步法?
dxy_gwrp7ndq
二步法是灵敏度比较高的方法,操作较三步法便捷
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问
WB最后条带曝不出来以及背景颜色很黑
迟C迟
背景黑考虑1.减少蛋白的上样量2.缩短曝光时间3.如果是化学发光,请减少超敏液的使用
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问
蛋白纯化有杂带怎么办
dxy_qm66y5m7
如果是his标签的话,首先与填料结合时使用的buffer里可以加点咪唑这样可以减少特异性结合,其次洗脱的时候可以适当提高咪唑浓度,加强对杂蛋白洗脱,最后就是更换填料的类型。以上只是对his标签蛋白提纯的优化,希望有帮助。
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问
慢病毒包装一个细胞可以进几个载体?细胞和包装系统的量怎么确定?一个细胞可以包装几个病毒,包装病毒后细胞会裂解吗?
bamboopiggy
这个要看你的包装系统是几质粒的,例如2代包装体系就是3质粒的,3代是四质粒的。然后这些质粒都要进入细胞才能完成包装。至于包几个病毒,要看你的操作水平了,水平高,病毒滴度就大。包装病毒后,细胞不能裂解,裂解了,就死了,没法产毒。
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问
这是形成引物二聚体了吗?但是为什么产物也很多
bamboopiggy
看位置是引物二聚体,只要有你的目的条带,你不要管这个二聚体就好。至于产物也多的原因,是因为你pcr反应的底物和酶,包括引物本来就是过量的,所以够合成你的目的条带。
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问
蛋白一直跑不出来,出来的位置也不太对
迟C迟
位置不对可能得原因有:1.胶浓度不对,不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差,可以调整浓度2.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度,延长孵育时间3)酶失活,建议直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物4)目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体,建议查询相关文献确定5)标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低,建议设置阳性对照比对结果,增加标本上样量
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问
代谢组学的数据怎么分析
天一湖医者
代谢组学分析数据用于统计分析时,数据集通常为一个N × K的矩阵(X矩阵),N表示N个样本数,每一行代表一个样品, K表示K个变量,每一列代表一个变量,在代谢组学中变量通常是指代谢物含量。最常用的分析方法如图
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问
蛋白纯化时超声多久以及功率多大比较合适?
迟C迟
保持低温,400W ,工作5秒间隔5秒,大概重复10-20次吧。
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问
有什么好用的软件根据氨基酸顺序构建蛋白质结构,计算蛋白质结构域,预测功能。
bamboopiggy
alphafold2和roseTTAfold两个是近期最火的。咱们国内的uni-fold,都是可以预测的。还有I-tasser,quark,swiss-model等。
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问
WB条带扭曲可能得原因有哪些
天一湖医者
电泳电流不均一,建议 换电泳槽,或者不使用两边的孔。
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问
WB中目的条带拖尾并且出现非目的条带
bamboopiggy
目的条带拖尾是因为蛋白上样浓度太高了,当然也可能是蛋白降解了。出现非目的条带,感觉就是蛋白降解了。在处理蛋白过程中,要注意低温。
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问
SDS-PAGE制胶的过程中发现分离胶底部总是出现花纹,而且影响跑胶结果,是什么原因呢?
bamboopiggy
我以前也遇到过,不要把你的目的蛋白跑的太往下,在还没有变形之前就停止电泳转膜,我当时是因为电泳槽的金属丝不好了。最下面的蛋白往两边分。
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问
膜蛋白怎么变性比较好?
bamboopiggy
蛋白一般还是要通过95-100度,煮一下来变性打开的,如果膜蛋白比较脆弱,考虑lysis里加蛋白酶抑制剂,并且将煮样时间缩短为5min
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问
IP用多克隆抗体结果能行吗?
vae1476
可以用的,而且有些情况下,由于能识别多个表位,多克隆抗体可在IP/ChIP中得到更好的结果。
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问
骨髓瘤做完骨髓穿刺术后,免疫电泳是否要做?做下来的结果是什么?
未来9
做了骨穿就可以,不一定要做免疫电泳。免疫固定电泳阳性不一定是骨髓瘤。血清免疫固定电泳是确定多发性骨髓瘤免疫分型的一种检查手段,它不仅可以显示血清中存在单克隆球蛋白,即M蛋白,还能明确该M蛋白的免疫类型,即IgM、Ig G、IgA、IgD或Ig E一中的任何一种,是多发性骨髓瘤的诊断标准之一。
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问
逆转录过程当中用的所有材料都是RNA级别的吗?EP管也要买特殊的吗?
迟C迟
是的,逆转录过程中的所有耗材都是经过处理的,最后逆转录成cDNA之后就可以用普通的EP管保存了。
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354 围观
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问
请问WB跑出来的条带跟目的条带大小有偏移是为什么?
vae1476
1. 确定蛋白是内源的还是外源的,如果是外源蛋白是不是全长序列;2. SWISSPROT 数据库查询该蛋白是否有其他 isoform;3. SWISSPROT 和文献查询蛋白质是否有剪切活化,剪切活化造成蛋白变小;4. 确定蛋白质是否是二聚体或多聚体。5. NCBI 和 SWISSPROT 查询蛋白质表达后是否有修饰,如有修饰会导致蛋白质增大;
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问
WB曝光选择电子照胶仪好还是胶片曝光好?利弊分析?
迟C迟
个人认为用胶片还是比较稳定的,而且灵敏度要比电子显影的方法高一些,对于一些比较弱的带来说比较适合,还有就是感觉背景好一些。
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问
wb和免疫组化可以用同一种抗体吗,抗体怎样保存最好。
迟C迟
可以到卖抗体的公司网站上查一下适用实验。抗体可以保存在50%的甘油存放于-20℃。也可以将其保存在饱和硫酸铵于4℃或-20℃保存。
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问
生物成像中细胞成像的应用
vae1476
可以通过心肌细胞激光共聚焦扫描显微图像进行观察
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