wb条带整个泳道都是黑的

可能：1.凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高，这样容易形成混乱一片。
2.可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全，也容易混乱。
3.样品溶解不好。
4.样品中含有不溶性颗粒。
5.加样量过多。

在软件上调整一下，认为可能是没有调整好，让一些非特异性的结合看不出来，只看你的主带。或者用锡纸挡住一部分，只看你要看的Kd大小的部位？

模糊的条带还是有的，那说明就有希望。感觉目前的工作是降背景，建议一抗和二抗用脱脂奶粉稀释，然后TBST多洗一两次。曝光时间也可以调短一点试试！

应该是非特异性结合，也可能蛋白存在降解

你这个，his的条带如果还行，但是目的蛋白的条带整个泳道都是黑的，说明蛋白没有问题，应该是非特异性结合。

1.二抗室温一小时足够；

2.洗膜每次最好能5minX4次

3.ecl稀释，压片时间缩短

1，将分离胶的浓度变为12%-13%
2，所有封闭和抗体稀释都用牛奶（5%）来，而不是BSA

你先用你的一抗跑个whole cell lysit试试，感觉确实是一抗不特异。