实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，有没有什么技巧可以更好的选择到合适的活化介质？

Eason老歌迷

当然是因地制宜，根据不同的需要选择合适的。现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好呢选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此可以选择自己适合的活化介质。

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问HPLC是用来分析检测or分离纯化?

一个小哭包

HPLC用来分析检测，。分离纯化都是可以的。HPLC的应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20% ，而80% 则需用高效液相色谱来分析。

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问蛋白纯化出现沉淀怎么回事？怎么解决呢？

天一湖医者

首先需要确定沉淀的诱因：pH值处于等电点附近、高盐下析出还是样品结构的稳定性，当然还有可能是HCP在作祟？第一种和第二种就比较简单，调整pH值或者盐浓度；第三种情况的话就需要做一些缓冲液的筛选以及添加剂的筛选；HCP的话就考虑增加去除HCP的淋洗工艺

3 回答6056 围观

问目的蛋白先洗脱杂蛋白被吸附怎么办？

一个小哭包

在洗脱缓冲液中加入醇类物质，洗脱过程中不易产生蛋白多聚体，可大幅提高目的蛋白的纯度。

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问洗脱采用的离子强度的大小范围应该如何确定

一个小哭包

洗脱不同蛋白的最恰当的离子强度液不一定一样，通常采用浓度梯度和PH梯度相结合的方式洗脱

3 回答385 围观

问原代细胞种板以后发现中间部分不长或者长得不好，请问会是什么问题导致？

天一湖医者

估计你是洗的时候将细胞吹动了，有时候细胞贴得不是很牢，换液时一定要小心，轻轻将旧培养基吸出，不能吹打；加新培养基时也要注意，沿着孔璧缓缓加入，不要直接对着孔中央加进去。

3 回答637 围观

问检测某种细胞类型中的miRNA

天一湖医者

MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒

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问实验过程中，切片边缘总是着色，怎么避免呢？

Eason老歌迷

你的试剂有没有充分覆盖标本组织?超出组织边缘2mm试一试

5 回答504 围观

问免疫组化实验中，如果所有的切片呈阴性，我们该怎么办？怎么确定不是假阴性？

Mani-F

仔细检查实验记录，确定所有步骤没出错，再用阳性对照确定抗体有没有问题，都没问题，那有可能切片就是阴性的。

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问蛋白质变性后，怎么样操作才可以尽可能的延长其保存期？

Eason老歌迷

一，切记蛋白质的储存标准:超低温、分装、浓缩、冷冻／速融、添加剂。二，如即提即用的话，可将浓缩蛋白质存储在单一溶液（如PBS），放置聚丙烯管或整洁的玻璃容器中，放到4°C冰箱储存。分析到适合的缓冲溶液中能够冻干，放4°储存；也能加浓度较高的的硫酸铵（你的蛋白质不沉积的话），4°储存。提纯后的蛋白质测浓度值后，添加50%凡士林，确定搅拌后分装，液态氮冷冻，放进-20度或-80度储存，特别是在适用抗氧

4 回答2389 围观

问怎么样更大程度上减少非特异性荧光染色？

Eason老歌迷

缩短一下一抗二抗孵化时间来看看?

4 回答152 围观

问提高蛋白质纯化的成功率有什么好的经验分享？

一个小哭包

蛋白质纯化工艺中的其他因素也会对蛋白质的稳定性产生影响。对蛋白质的处理步骤越少越好，在最短时间内采用最少步骤的纯化工艺才能保证得到最高产率的活性蛋白质。而且，在整个纯化过程中，蛋白质最好都保持在低温状态。一般纯化过程都在4°C进行,因为这个温度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情况下），又可以保证蛋白质的结构完整性。

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问如果目标蛋白是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂应如何调整？

Eason老歌迷

最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

3 回答533 围观

问核酸斑点杂交，样品点在铅笔同侧还是另外一侧

一个小哭包

应该是在哪一侧应该都可以，不影响实验

2 回答401 围观

问WB结果用imagej统计灰度值时降背景是必须的吗？

Eason老歌迷

正常的流程，是必须要降背景的。你要是想不弄，你可以试一试先，看看得出的结果可不可行。

3 回答573 围观

问肽段进质谱主要断的是什么键，形成哪些碎片离子？

Eason老歌迷

肽段在质谱中的碎裂有一定的规律，肽段母离子在质谱仪的碰撞室经高流速惰性气体碰撞解离，肽链在酰胺键出断裂并形成子离子，差生a、b、c型和x、y、z型系列离子。a、b、c型离子保留肽链N端，电荷留在C端；x、y、z型离子离子保留肽链C端，电荷留在离子N端。其中b型和y型离子离子在质谱图中较多见，丰度较高。y、b系列相邻离子的质量差，即为氨基酸残基质量，根据完整或互补的b、y系列离子可推算出氨基酸序列。

4 回答2015 围观

问用50mMHEPES，含4%SDS的裂解液裂解细胞得到的是细胞表面蛋白质吗

Eason老歌迷

总蛋白。得到的蛋白可以用来电泳，

3 回答244 围观

问犬埃立克体virb9基因的表达

Eason老歌迷

是不是，实验中某个步骤没有做好呢？回顾检查一下。

3 回答260 围观

问求常用的产生物膜的细菌菌种？

一个小哭包

目前，对生物膜研究最多的是表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等

3 回答997 围观

问关于APSite问题？

Eason老歌迷

两者原理并不一样。对ssdna并无作用。不能。

3 回答416 围观

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